SXZG藥物對去卵巢大鼠牙槽骨轉化生長因子-β1及腫瘤壞死因子-α表達的影響

從 叢，魏霞臻，譚國琴

1.長安大學醫院，陜西 西安 710064；2.西安交通大學陜西天奎生物醫藥科技有限公司，陜西 西安 710061；3.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四五醫院，四川 雅安 625000

骨質疏松癥是中老年人的常見性疾病，尤其是絕經后女性由于卵巢功能減退，機體內的雌激素水平下降，使骨吸收超過骨形成，從而導致骨質疏松癥的發生［1-2］。研究顯示，絕經后女性因雌激素缺乏引起的全身骨密度降低與頜骨骨組織礦化物丟失密切相關，并且可進一步導致牙槽骨高度和密度的降低［3］。在骨組織微環境中，轉化生長因子TGF-β1和腫瘤壞死因子TNF-α與骨組織的形成和吸收關系密切，它們對骨代謝過程中成骨細胞和破骨細胞的分化、增殖及功能活性的調控具有重要意義［4-5］。SXZG是以沙棘油脂肪酸以及棕櫚酸等不飽和脂肪酸為主要成分的中成藥，前期研究已經證實SXZG可以降低絕經后骨質疏松癥的發病，抗組織細胞衰老，改善血流流變性，調節內分泌及免疫功能，但是其是否可以防治絕經后頜骨骨量丟失、牙槽骨骨質疏松目前還沒有研究。本實驗通過制作去卵巢骨質疏松大鼠下頜骨磨牙區牙槽骨免疫組化染色切片，觀察用藥后大鼠下頜牙槽骨中TGF-β1及TNF-α的表達變化，推斷SXZG藥物對去卵巢大鼠牙槽骨的作用。

1 動物模型和研究方法

1.1 實驗動物

選擇8月齡SD雌性大鼠60只，3月齡SD雌性大鼠10只，平均體重為（290±20）g；均為SPF（無特殊病原體）級；動物合格證號：SCXK（京）2009-0004，由北京醫科院實驗動物研究所提供。實驗動物分籠、標準飼料喂養，溫度保持在21±2℃，濕度維持在65%±5%，可自由攝食、攝水。記錄進食量，攝水量。

1.2 制備動物模型

（1）用隨機抓取發法在60只SD大鼠中選取50只作為去勢組，10只為假手術組。（2）將2%戊巴比妥鈉注入去勢組50只大鼠的腹腔內進行全麻，摘除大鼠雙側卵巢，術后分層縫合肌肉及皮膚；假手術組的10只大鼠在被全麻后則只打開腹腔，而并不切卵巢，術后將肌肉及皮膚分層縫合。（3）手術3個月后，隨機抽取去勢組大鼠10只，與假手術組的10只大鼠比較，用雙光子骨密度測定儀（美國HOLOGIC）檢測大鼠脛骨、腰椎、股骨三個部位的的骨密度。用SPSS 19.0軟件對骨密度數據進行兩樣本均數比較的配對t檢驗，各組實驗數據以（±s）表示，實驗結果顯示兩組間脛骨、股骨骨密度比較P＜0.05，腰椎骨密度比較P＜0.01，表明去勢組骨密度與假手術組相比，其骨密度顯著下降，脛骨，股骨，腰椎的骨密度比較均具有顯著性差異，說明骨質疏松模型建模成功。

1.3 研究方法

將50只去勢大鼠隨機分為五組，每組10只，其中四組分別灌藥喂服不同的藥物，即實驗藥物SXZG劑量1，SXZG劑量2，己烯雌酚片，仙靈骨葆膠囊，剩下一組去勢模型組與假手術組喂服空白乳劑，另設一組10只3月齡SD雌性大鼠為青年對照組，喂服空白乳劑，最終共計七組，SXZG藥物由西安交通大學天奎生物醫藥科技有限公司供，己烯雌酚購自合肥久連制藥有限公司，仙靈骨葆膠囊購自貴州同濟堂制藥有限公司，分組如表1所示。

表1 實驗大鼠分組

1.4 下頜骨免疫組化染色觀察

解剖分離出下頜骨，置于4%甲醛中固定一周，固定后將下頜骨放入EDTΑ脫鈣液（0.5 mol/L，pH=7.0）中充分脫鈣8周，脫鈣后截取下頜骨第三磨牙及周圍牙槽骨，梯度酒精脫水，二甲苯透明，進行組織浸蠟與包埋，制作第三磨牙區骨組織連續切片。將石蠟切片按照試劑說明操作步驟分別進行TGF-β1及TNF-α免疫組化染色，樹膠封片，普通光鏡下觀察免疫組化染色情況。將所有免疫組化切片經激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica TCS SP2型）照相，每個切片取3個視野，采用西安交通大學醫學院motic med 6.0數碼圖像分析系統測定每個視野的陽性染色灰度，并計算平均灰度值。兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體及兔抗鼠TNF-α多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠牙槽骨TGF-β1及TNF-α免疫組化染色觀察

免疫組化結果以胞漿呈棕黃色染色為陽性表達，光學顯微鏡下可見各組大鼠牙槽骨中TGF-β1及TNF-α在骨小梁周圍的成骨細胞、骨細胞以及骨基質中有不同程度的表達，見圖1。

圖1 各組大鼠牙槽骨中TGF-β1及TNF-α的表達

2.2 各組大鼠牙槽骨中TGF-β1及TNF-α表達灰度值比較

灰度值是對細胞因子表達強弱的體現，其數值越大，表示細胞因子表達的量越小。本實驗中，不同組別牙槽骨中TGF-β1及TNF-α的表達不同，去勢組E組與假手術組F組相比，牙槽骨中TGF-β1表達明顯減少（P＜0.05），TNF-α表達明顯增多（P＜0.05），差異具有統計學意義；A組、B組牙槽骨中TGF-β1陽性表達均較E組增多（P＜0.05），TNF-α陽性表達均較E組減少（P＜0.05），差異具有統計學意義；A組、B組牙槽骨中TGF-β1及TNF-α的陽性表達與假手術組F組相比，差異均沒有統計學意義（P＞0.05）；陽性對照組C組與D組牙槽骨中TGF-β1表達均高于E組（P＜0.05），TNF-α表達均有所降低（P＜0.05），差異具有統計學意義，見表2。

表2 各組大鼠牙槽骨中TGF-β1及TNF-α表達灰度值

3 討論

臨床和實驗研究發現，雌激素長期缺乏不僅導致骨質疏松，還可造成牙槽骨丟失，即絕經后婦女在發生全身性骨質疏松時往往伴隨頜骨及牙槽骨的骨質疏松［6］。有學者研究認為［7］，骨質疏松癥患者相較于非骨質疏松癥患者，更易發生牙齒附著喪失和牙槽骨喪失，且絕經后骨質疏松癥女性牙周炎的發生率和嚴重程度會明顯增加。在骨代謝過程中，有許多細胞因子參與骨吸收和骨形成的調控，其中有些細胞因子可以促進破骨細胞前體細胞的分化和成熟，增加破骨細胞的活性，使骨吸收增加；有些細胞因子可抑制破骨細胞的增殖及激活，增加骨形成。 TGF-β1對骨代謝具有重要的調節作用，TGF-β1能促進成骨細胞生長，誘導骨膜間充質細胞增殖、分化為成骨細胞，并刺激Ⅰ型膠原合成，促進成骨細胞外基質的合成和鈣化，從而調控骨組織改建，對骨形成具有重要意義［8-10］。李凝旭等對135名絕經后女性研究發現，絕經后骨質疏松患者血清中TGF-β1的含量較正常者降低［11］。本實驗中，TGF-β1在大鼠牙槽骨的成骨細胞、部分骨細胞以及骨基質有表達，與假手術組相比，去勢組大鼠牙槽骨中TGF-β1表達減少，說明大鼠摘除卵巢后，隨著雌激素水平的降低，牙槽骨的成骨活動到抑制；經SXZG藥物治療后，大鼠牙槽骨中TGF-β1陽性表達較去勢組增多，說明SXZG藥物可以增加去卵巢大鼠牙槽骨的形成。

TNF-α是破骨細胞因子，有學者認為TNF-α是刺激骨吸收所必需的，TNF-α可直接作用于破骨細胞，刺激骨吸收，也可抑制骨膠原的表達及成骨細胞的分化，通過增加骨膠原酶的分泌使骨基質加速降解，進而影響骨形成［12］。有學者研究發現［13］，絕經后雌激素缺乏可引起血清TNF-α等細胞因子水平的升高。亦動物實驗發現［14］，小鼠切除卵巢后，雌激素水平降低，T細胞分泌的TNF-α明顯增加， TNF-α可促進破骨細胞的形成和骨吸收。本實驗中，與假手術組相比，去勢組牙槽骨中TNF-α的表達增多，說明大鼠在摘除卵巢后，隨著雌激素水平的下降，TNF-α介導的牙槽骨骨吸收活動增強，經SXZG藥物治療后，SXZG劑量1組、SXZG劑量2組牙槽骨中TNF-α陽性表達均較去勢組減少，說明SXZG藥物可抑制去卵巢大鼠牙槽骨的骨吸收活動。

綜上所述，SXZG可增加去卵巢骨質疏松大鼠牙槽骨中成骨細胞因子TGF-β1的表達，減少牙槽骨中破骨細胞因子TNF-α的表達，以此推論SXZG藥物對去卵巢骨質疏松大鼠牙槽骨骨質破壞有抑制作用，可預防因雌激素水平下降導致的槽骨骨量減少。