羊草LcCBF6基因的表達特性和功能研究

李倩，李曉霞，程麗琴，陳雙燕，齊冬梅，楊偉光，高利軍，新巴音，劉公社

（1.中國科學院植物研究所北方資源植物重點實驗室，北京100093；2.山東省淄博第七中學，山東 淄博255000；3.黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江 齊齊哈爾161005）

CBF（C-repeat binding factor）基因是植物重要的抗逆基因，其屬于AP2/ERF（ethylene response factor）轉錄因子家族，AP2/ERF 可分為AP2、ERF 和RAV 三個亞家族［1］。ERF 包括CBF/DREB 和ERF 兩個亞家族，CBF/DREB 亞家族，只含1 個AP2/ERF 結構域。CBF 轉錄因子二級結構的C 末端為轉錄激活區，富含酸性氨基酸。N 末端為核定位信號區，富含堿性氨基酸，中間區為AP2/EREBP 結構域［2］。目前，CBF基因家族已經在多種植物中得以研究，其中擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組中有6 個DREB1/CBF基因，即DREB1B/CBF1、DREB1C/CBF2、DREB1A/CBF3、DREB1D/CBF4、CBF5、CBF6［3-5］。1997年Stockinger 從擬南芥中首次克隆出CBF1基因［6］。Jaglo-Ottosen 等［7］研究表明擬南芥CBF1是與CRT/DRE 序列結合的轉錄激活因子，CBF1過表達誘導COR（cold-regulated）基因表達，提高了擬南芥的抗冷性。1998年Gilmour 等［3］利用探針從擬南芥中分離出CBF2和CBF3基因，同時發現CBF1、CBF2和CBF3基因串聯布置在擬南芥基因組的4 號染色體的8.7 kb 區域，與CBF1一樣，CBF2和CBF3也受冷脅迫誘導，可與CRT/DRE 序列結合。2002年Haake 等［4］在擬南芥中獲得了CBF4基因，該基因受干旱誘導，不受低溫誘導。CBF4同樣激活CRT/DRE，這些下游基因參與冷和干旱響應，轉基因擬南芥更耐冷和干旱脅迫。擬南芥CBF5 蛋白最初是由Maceluch 等［8］和Lermontova 等［9］克隆得到的，AtCBF5可能在RNA 加工中具有必不可少的作用。Magome 等［10］從擬南芥中分離出一種新的赤霉素（gibberellin，GA）缺陷型突變體ddf1。DDF在系統發育上接近DREB1/CBF基因，DDF1被高鹽脅迫誘導，過表達DDF1的轉基因植物對高鹽度脅迫的耐受性增強，參與了GA 生物合成和脅迫耐受性的調節。擬南芥DDF2/CBF6是由鹽脅迫而不是由冷脅迫誘導的［11］，目前關于擬南芥CBF5和CBF6的報道較少。除擬南芥外，研究人員也對其他植物CBF基因進行了研究。在小麥（Triticum aestivum）中，大多數CBF基因位于5 號染色體的長臂上，與耐冷基因具有緊密的聯系［12］。Choi 等［13］從大麥（Hordeum vulgare）中克隆了HvCBF3基因，其定位在5 號染色體上，位于抗寒數量性狀基因座的附近。Dubouzet 等［14］從水稻（Oryza sativa）中分離了5 組CBF基因，研究表明A-1 組基因由低溫誘導，而A-2 組基因由鹽和干旱誘導。過表達OsCBF基因的轉基因水稻的抗寒性、抗旱脅迫性、抗鹽性都得到提高［15］。葡萄屬（Vitis）的CBF4基因主要由冷誘導，CBF1，CBF2和CBF3基因對干旱脅迫具有更好地響應［16］。總之，在非生物脅迫條件下，轉錄因子CBF 可以識別下游COR基因啟動子上的順式作用元件CRT/DRE，激活COR基因的表達，其參與冷、干旱、鹽等多種脅迫信號途徑，可提高植物抗逆性［17］。

羊草（Leymus chinensis）是禾本科多年生牧草及生態草，廣泛分布于歐亞草原的東部，是草原的優勢種。其生態適應范圍廣，抗逆性強，是天然的抗逆基因資源庫［18］。且其營養價值高、可再生能力強，能有效改良草原生態環境［19］。系統發育分析表明，羊草與小麥和大麥具有密切的系統發育關系［20］。因此，關于羊草抗逆研究在草原修復和作物抗逆性提高等方面都具有重要價值。前期研究表明羊草的非生物脅迫響應途徑主要有3 個：ABA、JA 和CBF 途徑［21］。其中CBF 途徑是擬南芥和水稻中的典型冷應答途徑。本課題組前期已對抗逆相關的轉錄因子進行了大量研究，結果表明LcDREB2a和LcMYB1基因可提高轉基因擬南芥的抗鹽性［22-23］。Li 等［24-25］從羊草中克隆獲得羊草鹽脅迫誘導新基因LcSAIN1和LcSAIN2，發現過表達這兩個基因可提高轉基因植物對鹽脅迫的抗性。Gao 等［26］發現了一種新型的轉錄因子LcFIN1，其被冷脅迫誘導，可能參與冷脅迫的早期響應，增強轉基因植物的冷脅迫耐受性，LcCBF1與位于LcFIN1啟動子區域的CRT/DRE 順式元件結合，LcFIN1受LcCBF1直接調節，而關于羊草CBF基因家族一直缺少系統的研究。本研究克隆得到羊草的CBF6（L.chinensisC-repeat binding factor 6）基因，將其轉入擬南芥中進行功能驗證，這為羊草CBF基因家族功能解析及牧草的抗逆分子機制提供重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羊草材料種植地為中國科學院植物研究所羊草種質資源圃（東經116°12′，北緯39°59′）。羊草種子采用雙層濾紙法萌發，光照強度40 lx，相對濕度35%，溫度（28 ℃，12 h 晝）/（16 ℃，12 h 夜）中進行萌發試驗。在培養皿中培養至5～6 cm 幼苗時，移栽至混合土（混合比例營養土∶蛭石為2∶1）中培養，材料收集時間為2018年。擬南芥野生型（ecotype Columbia，Col-0）種植于培養室中，培養介質為營養土與蛭石（2∶1）混合土，溫度為23 ℃。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 材料處理 羊草LcCBF6基因的組織特異性表達模式分析：選取正常生長8 周的耐鹽羊草種質W3 和敏鹽羊草種質S4，分別取根、葉、種子組織，液氮速凍，-80 ℃超低溫儲藏。鹽脅迫處理下羊草基因LcCBF6表達模式分析：選取正常生長8 周的耐鹽羊草種質W3 和敏鹽羊草種質S4，進行高鹽（200 mmol?L-1NaCl）處理4 h，取根和葉。同時，取200 mmol?L-1NaCl 處理4 h 的種子材料，液氮速凍，-80 ℃超低溫儲藏。

1.2.2 總RNA 提取和cDNA 合成 將羊草材料分別按照各自試驗設計進行處理，各處理取材料0.1 g，5 次重復。用多糖多酚植物RNA 提取試劑盒（華越洋，北京），提取各處理材料總RNA，并用DNaseI（Takara，Japan）消化DNA，具體操作參照試劑盒說明書。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳和Biodropsis BD-2000 進行RNA 質量檢測。將提取出的RNA 使用PrimeScript?RT Reagent Kit 試劑盒進行反轉錄合成cDNA。反應體系為10 μL：5×PrimeScript? Buffer（4 μL），PrimeScript? RT Enzyme Mix I（1 μL），Oligo dT Primer（1 μL），Random 6 mers（1 μL），Total RNA（1 μg），RNase-free dd H2O（up to 10 μL）。反應條件：37 ℃30 min；85 ℃15 s，合成后的cDNA 存貯于-20 ℃備用。

1.2.3 基因克隆及載體構建 通過檢索本課題組前期羊草鹽脅迫轉錄組數據庫，獲得CBF6基因序列。將該序列在NCBI 上比對發現該序列為CBF家族基因，命名為LcCBF6，根據其保守序列，用Primer 5 設計基因序列克隆引物：LcCBF6-F（GGACTGAATCGGAGGAAGAAGA），LcCBF6-R（GTGACCGTACAGCAGCACAAA），以cDNA 為模板，進行PCR 擴增反應［27］。冰上配制反應液，模板最終濃度為10～20 ng ? μL-1，混勻后離心，PCR反應程序：95 ℃5 min；35 個循環（95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，2 min）；72 ℃，2 min。PCR 反應體系為20 μL：10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+Plus）（2 μL），dNTP Mixture（3.2 μL），cDNA（100 ng），Primer-F（0.6 μL），Primer-R（0.6 μL），LA Taq（0.2 μL），ddH2O（up to 20 μL）。取5 μL 擴增產物用1%瓊脂糖凝膠分離PCR 產物，將目的片段用膠回收試劑盒回收（上海生工），方法參照試劑盒說明書。回收產物利用帶有酶切位點的引物：XbaI（TCTAGAATGTGTCCGATCAAGAAGG），SacI（GAGCTCCTAGCTAGCTGTGGTAGCT）進 行PCR 擴增，膠回收得到的序列即為帶有酶切位點的LcCBF6基因序列。

將上述膠回收產物連接到pMD19-T 克隆載體，轉化到大腸桿菌DH5a，并進行測序分析。用TaKaRa miniBEST 質粒提取試劑盒分別提取pMD19-T-LcCBF6與pSN1301 質粒，利用XbaI 和SacI 分別對pMD19-TLcCBF6和pSN1301 質粒進行酶切并連接，具體操作參照試劑盒說明書。

1.2.4LcCBF6基因生物信息學分析 通過NCBI 數據庫進行LcCBF6基因及同源基因序列的搜索和比對（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；使用DNAMAN 進行多序列比對；使用ClustalX 2 和MEGA 6.0 進行蛋白質比對分析及系統進化樹構建；使用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對LcCBF6進行蛋白特性分析。

1.2.5LcCBF6基因表達分析 根據LcCBF6基因序列設計熒光定量引物為：LcACTIN-F（TGCTGACCGT ATGAGCAAAG），LcACTIN-R（GATTGATCCTCCGATCCAGA），LcCBF6-F（AGTCGTCCTCTTCCCCA GCG），LcCBF6-R（CGTAGTACAGGTCCCAGCCCAT），羊草Actin基因序列為內參引物［24-25］。采用熒光定量PCR 方法，分析羊草LcCBF6在羊草不同組織（種子、根、葉）中NaCl 處理下的表達情況。定量PCR 體系和條件按照（TaKaRa LA Taq?，RR02MA，TaKaRa）試劑盒說明書進行操作。反應程序為：95 ℃，30 s；45 個循環（95 ℃，5 s；68 ℃，30 s）。定量PCR 反應完成后，采使用2-ΔΔCt方法對所得數據進行分析［28］。

1.2.6 擬南芥轉化及陽性苗PCR 鑒定 將構建好的融合載體pCAMBIA-3301-LcCBF6轉入農桿菌GV3101中，采用花序侵染法［29］將處于花蕾期的野生型擬南芥的花序浸泡在侵染液中，保持1～2 min，侵染后以較高的濕度在培養箱中暗培養24 h 后正常培養，直至擬南芥正常開花結果，收獲種子。將轉化后的擬南芥種子，用10%的次氯酸鈉進行滅菌，將滅過菌的種子種植于含50 μg?mL-1潮霉素或卡那霉素（kanamycin，Kan）的固體MS 培養基上，并將經過抗性篩選后仍然長勢良好的擬南芥初步確定為陽性苗。將陽性幼苗移栽到土里繼續生長，待其生長狀態良好后，提取葉片基因組DNA，用PCR 法進一步鑒定，陽性苗PCR 鑒定引物：LcCBF6-F（ATGTGTCCGATCAAG AAGGAG），LcCBF6-R（CTAGCTAGCTGTGGTAGTTCCA）。T1代種子種植后單株所收種子為T2代，理論上T2代應該出現3∶1 的分離，選取T3代中的純合體株系進行生物學試驗分析。

1.2.7LcCBF6轉基因擬南芥耐鹽分析 種子萌發階段耐鹽性試驗：將3 個LcCBF6轉基因擬南芥株系（Line1、Line2、Line5）和野生型擬南芥的種子播種在含有0，100，125，150 和200 mmol?L-1NaCl 的MS 培養基（MS 粉4.4 g，蔗糖30 g，瓊脂粉15 g，加水至1000 mL，pH 5.8）上。萌發溫度設置為23 ℃，每皿40 粒種子，3 次生物學重復，觀察種子的萌發情況，并統計綠色子葉數和鮮重。鹽脅迫根長抑制試驗：將LcCBF6轉基因擬南芥3個株系（Line1、Line2、Line5）及野生型擬南芥的種子分別播種在MS 培養基上生長4 d 后，將其幼苗移栽到含有0，100，125，150 和200 mmol?L-1NaCl 的MS 培養基上，3 次生物學重復，斜放培養基，1 周后測量根長。幼苗抗鹽試驗：將LcCBF6轉基因與野生型擬南芥種子在MS 培養基萌發7 d 后，將長出的幼苗分別移栽到含有0，100，125，150 和200 mmol?L-1NaCl 的MS 培養基上。繼續培養3 周后，觀測幼苗的生長狀況并統計其存活率和鮮重，3 次生物學重復。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 和SPSS 軟件對所得數據進行統計分析，使用Microsoft Excel 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 羊草LcCBF6 基因的克隆及結構功能預測

依據基因轉錄組測序數據設計引物，從羊草中克隆得到LcCBF6基因，該基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）為738 bp。使用ProtParam 對LcCBF6 進行蛋白特性分析，發現LcCBF6ORF 編碼245 個氨基酸，分子量為26 kD，等電點（isoelectric point，PI）為6.45。NCBI 序列比對發現LcCBF6 存在大量相似蛋白，均含有保守的AP2 結構域，屬于該家族轉錄因子。LcCBF6 與蒙古冰草（Agropyron mongolicum）CBF6 蛋白同源性最高，為92%，其次與兩芒山羊草（Aegilops biuncialis）CBF6 蛋白的同源性為90%，與山羊草（Triticum triunciale）CBF6蛋白的同源性為88%，與黑麥（Secale cereale）、小麥、大麥和黑麥草（Lolium perenne）的CBF6 蛋白的同源性分別為91%、88%、91%、76%（圖1）。利用MEGA 構建了LcCBF6 及其同源蛋白的系統進化樹，發現羊草LcCBF6 在進化上與小麥、大麥、蒙古冰草、黑麥和山羊草的親緣關系較近（圖2）。

圖1 LcCBF6 基因編碼蛋白序列比對分析Fig.1 Sequence alignment analysis of LcCBF6 gene coding protein

圖2 LcCBF6 系統進化樹Fig.2 LcCBF6 phylogenetic tree

2.2 羊草基因LcCBF6 的表達模式分析

組織特異性分析結果表明，LcCBF6基因在羊草的種子、葉、根中的表達存在差異，根中表達量最高，種子次之，葉中最低。耐鹽性不同的兩種羊草種質中LcCBF6的表達量存在差異，該基因在耐鹽種質W3 的表達量高于敏鹽種質S4（圖3A），推測羊草LcCBF6基因與植物耐鹽性相關。

對羊草敏鹽種質S4 和耐鹽種質W3 進行200 mmol?L-1NaCl處理4 h 后，分別提取種子、葉、根的RNA，對不同組織中LcCBF6的表達模式進行檢測，結果表明在鹽脅迫下，種子和葉片中LcCBF6基因均上調，但耐鹽種質W3 的上調倍數大于敏鹽種質S4。根中敏鹽種質S4 的LcCBF6基因上調，耐鹽種質處理前后差異不顯著（圖3B）。這表明LcCBF6基因受鹽誘導表達，且不同耐鹽性種質中的表達存在差異，推測該基因可能參與植物對鹽脅迫的響應。

圖3 LcCBF6 基因的表達模式Fig.3 Expression patterns of LcCBF6 gene

2.3 鹽脅迫對過表達LcCBF6 擬南芥種子萌發的影響

為了進一步明確LcCBF6的基因功能，本研究構建了雙子葉植物表達載體pCAMBIA3301-LcCBF6（圖4A），并進行擬南芥轉化，在獲得的轉基因株系中，選取3 個株系（Line1、Line2 和Line5，圖4B）的T3代純合體種子對鹽脅迫下的萌發情況進行檢測。結果表明萌發期鹽脅迫對野生型和轉基因擬南芥的綠色子葉數和鮮重均產生影響。但與野生型植株比較，這種生長抑制在LcCBF6轉基因植株中表現較輕。在125 mmol?L-1NaCl 處理下，野生型植株的綠色子葉率為16%，3 個轉基因植株的綠色子葉率分別為30%、52%和50%。測定植株鮮重發現，在對照條件下，轉基因和野生型鮮重沒有顯著差異。但是，在125 mmol?L-1NaCl 處理下，野生型鮮重為26.66 mg·10 plant-1，3 個轉基因擬南芥的鮮重分別為41.66、57.33 和51.33 mg·10 plant-1。即在鹽脅迫下，轉基因擬南芥的綠色子葉數和鮮重均顯著高于野生型（圖5）。

圖4 植物表達載體pCAMBIA3301-LcCBF6 酶切鑒定及轉基因株系PCR 鑒定Fig.4 Identification of plant expression vector pCAMBIA3301-LcCBF6 by enzyme digestion and PCR identification of transgenic line

圖5 NaCl 脅迫對LcCBF6 轉基因擬南芥種子萌發的影響Fig.5 Effects of LcCBF6-over-expressing Arabidopsis seed germination under NaCl stress（mean±SD，n=3）

2.4 鹽脅迫對LcCBF6 過表達擬南芥幼苗期的影響

進一步對轉基因和野生型擬南芥幼苗期耐鹽性進行比較。將在MS 培養基上培養7 d 的轉LcCBF6基因和野生型擬南芥幼苗移栽到含有不同NaCl（0～200 mmol?L-1）的培養基上，選擇長勢相同的擬南芥幼苗移苗，3 周后觀察生長情況。結果表明，在無NaCl 處理的情況下轉基因和野生型株系生長狀況較好；但在150 mmol?L-1NaCl 處理下，野生型植株大部分枯萎，轉基因植株大部分仍然存活（圖6）。

存活率統計發現150 mmol?L-1NaCl 處理3 周后野生型存活率為47.22%，LcCBF6三個轉基因擬南芥株系存活率分別為86.11%、91.66%和83.33%。200 mmol?L-1NaCl 處理下，野生型存活率為5.56%，而LcCBF6轉基因擬南芥3 個株系的存活率分別為55.56%、36.11%和41.67%。同時，每個處理取10 株幼苗統計其鮮重，發現150 mmol?L-1NaCl 處理下，野生型的鮮重為238 mg·10 plant-1，而3 個LcCBF6轉基因擬南芥株系的鮮重分別為311、302 和384 mg·10 plant-1。200 mmol?L-1NaCl 處理下，野生型擬南芥鮮重為99 mg·10 plant-1，而3 個轉LcCBF6基因植株鮮重分別為170、223 和178 mg·10 plant-1（圖6）。這表明LcCBF6轉基因株系幼苗期耐鹽性顯著高于野生型，即LcCBF6基因可以增強幼苗期擬南芥的耐鹽性。

圖6 轉LcCBF6 基因擬南芥幼苗抗鹽表型Fig.6 Salt-resistant phenotype of LcCBF6-over-expressing Arabidopsis in seedlings stage（mean±SD，n=3）

2.5 轉LcCBF6 基因提高鹽脅迫下轉基因擬南芥根長

為了研究鹽脅迫對轉基因擬南芥根系的影響，將擬南芥幼苗移栽到含有0～200 mmol?L-1NaCl 的培養基中，斜放培養皿，生長7 d 后測量根的伸長率。發現野生型和轉基因植株在對照條件下根長沒有顯著差異。但是，150 mmol?L-1NaCl 脅迫后野生型擬南芥植株根長僅為13 mm，而轉LcCBF6基因植株3 個株系的根長分別為15、20 和24 mm（圖7），這說明轉LcCBF6基因減輕了鹽脅迫對擬南芥根長的抑制作用。

圖7 NaCl 脅迫對LcCBF6 轉基因擬南芥根長影響Fig.7 Effects of NaCl stress on root length of LcCBF6-over-expressing Arabidopsis plants（mean±SD，n=3）

3 討論

逆境脅迫對農作物產量和生態環境造成極大的威脅，牧草植物對外界環境具有較強的適應能力，因此挖掘牧草植物抗逆基因，分析其抗逆機制已經成為當下的研究趨勢［30］。CBF 轉錄因子，也稱為DREB1 蛋白，是植物抗逆相關的轉錄因子。研究表明CBF 轉錄因子識別CRT/DRE 順式作用元件，只含1 個AP2/ERF 結構域，含有保守CCGAC 序列，當植物受到低溫脅迫后，CBF基因迅速激活下游COR基因。目前已經在許多植物物種中分離出CBF基因，例如擬南芥［2］、大豆（Glycine max）［31］、番茄（Lycopersicon esculentum）［32］、小麥［11］、大麥［12］和玉米（Zea mays）［33］等。在擬南芥中，CBF1、CBF2和CBF3主要參與冷脅迫相關途徑，CBF4參與冷和干旱響應途徑，CBF5和CBF6主要受高鹽脅迫誘導［10-11］，這表明擬南芥CBF基因家族存在功能分化［34］。而羊草是草甸草原的建群種，抗逆性強，具有優越的草地生產性能，因此對羊草抗逆基因資源方面的研究意義重大［35］。本研究對羊草CBF6基因進行克隆及分析，結果表明，LcCBF6含有保守的AP2 結構域，屬于CBF基因家族，與小麥CBFFIIIa-6.1基因同源性為88%（圖1）。有研究表明CBFIIIa-6.1在冬季小麥品種中表達量高，并且受冷脅迫誘導［36］。同時LcCBF6與大麥HvCBF6基因同源性為91%，研究發現HvCBF6對冷處理延遲響應，在冷處理8 h 后首次檢測到，并在24 h 達到峰值，HvCBF6激活COR基因在無冷脅迫（即溫暖）條件下的表達［37］。系統進化分析發現羊草LcCBF6在進化上與小麥、大麥親緣關系較近（圖2）。因此，推斷LcCBF6基因功能可能與CBFIIIa-6.1、HvCBF6具有相似性，參與植物對非生物脅迫的響應。

前期研究表明，羊草CBF基因家族基因的表達具有組織特異性，其中LcDREB3a在葉中表達量最高，其次是橫走根莖和根，在葉鞘中的表達量最低［38］。而本研究發現LcCBF6基因在根中表達量最高，種子中表達量次之，葉中表達量最低，這表明羊草CBF基因家族不同基因的組織表達情況存在差異。此外，前人研究發現擬南芥AtCBF6在鹽脅迫下，影響赤霉素（gibberellin，GA）的表達水平，導致侏儒癥和延遲開花等［11］。而本研究表明耐鹽性不同的兩種羊草種質中LcCBF6的表達量存在差異，耐鹽種質W3 的LcCBF6基因表達量高于敏鹽種質S4。同時，在鹽脅迫條件下，種子和葉片中LcCBF6基因均上調，且耐鹽種質W3 的基因上調倍數大于敏鹽種質S4；根中敏鹽種質S4 鹽脅迫后LcCBF6基因上調，耐鹽種質W3 處理前后LcCBF6基因差異不顯著（圖3）。上述結果表明該基因受鹽誘導表達，并且可能與羊草耐鹽性相關。

Zhang 等［32］從番茄中克隆到了LeCBF1～LeCBF3（L.esculentum CBF1-3）基因，其中LeCBF1參與冷脅迫響應。Qin 等［33］使用酵母單雜交技術分離玉米的ZmDREB1A基因，ZmDREB1A受冷和高鹽脅迫誘導，可提高轉基因擬南芥的抗旱和抗凍能力。Xiao 等［39］從野葡萄（Vitis riparia）和栽培葡萄（Vitis vinifera）中分離出CBF1～CBF3基因，研究表明寒冷、干旱和外源脫落酸（abscisic acid，ABA）均能誘導葡萄CBF基因的表達。Kidokoro 等［31］從大豆中鑒定出14 種GmDREB1s，GmDREB1 激活GmPYL21的表達，不依賴ABA途徑增強ABRE 介導的基因表達，激活HSF，再激活HSP 參與植物耐熱途徑，GmDREB1基因在提高植物耐熱性和抗旱性中發揮重要作用。這些結果表明CBF 途徑不僅在參與植物抗冷調節，在干旱和鹽堿脅迫途徑中也發揮了關鍵性的作用。本研究發現，過表達LcCBF6可以顯著提高轉基因擬南芥的抗鹽性，表明LcCBF6基因可能參與植物對鹽脅迫響應，提高轉基因植株的耐鹽性（圖5～7），這與前人研究的擬南芥CBF6基因功能具有一定的相似性［11］。本研究結果進一步豐富了羊草抗性基因資源，為牧草及重要農作物的抗逆分子育種提供了優異基因資源。