鹽處理下旱生植物沙芥蛋白激酶相關基因的差異表達分析

汪芳珍，楊成行，何子華，林子茹，曾浩源，馬清

（蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅蘭州730020）

我國西北荒漠、半荒漠地區氣候干旱、降水稀少、蒸發量大，長期以來，人工灌溉是該地區農業生產中主要的補水措施［1］。雖然人工灌溉在短期內可以迅速提高土壤的表層含水量，但由于風沙和高溫天氣的頻發，土壤深層鹽分往往會隨強烈的水分蒸發轉移到地表，造成根際土壤發生次生鹽漬化［2-6］。因此，土壤次生鹽漬化問題已成為制約我國西北地區農牧業發展和生態恢復的主要因素之一［1］。大多數農作物和牧草長期在耕作條件下栽培種植，其抗鹽性的遺傳潛力十分有限，這也是土壤鹽漬化限制農牧業生產的重要原因。從嚴酷環境中尋求具有極強抗逆能力的植物，挖掘其抗逆基因資源用于農作物及牧草抗逆性遺傳改良已成為目前國際上的研究熱點［7-8］。沙芥（Pugionium cornutum）為十字花科（Cruciferae）沙芥屬（Pugionium）多漿旱生植物，主要分布于我國西北和內蒙古西南部的荒漠地帶，為我國特有種，具有極強的抗旱性，同時對鹽漬環境具有極強的適應能力［9-11］。深入研究其耐鹽機制，并挖掘其蘊涵的豐富抗逆基因資源，將為農作物和優良牧草抗逆性遺傳改良提供重要的理論依據。已有研究發現，鹽脅迫下沙芥體內超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）酶活性顯著升高，有助于清除氧自由基進而減輕鹽脅迫對膜的過氧化［12］；5～25 mmol·L-1NaCl 能顯著促進沙芥的生長，且隨著鹽濃度增加，其體內主要滲透調節物質，如Na+、Cl-、SO42-、PO43-等含量均升高，以提高鹽脅迫下植株的滲透調節能力［5-6］。最新研究發現，沙芥在鹽脅迫下能通過吸收并區域化大量Cl-至地上部作為滲透調節劑來維持細胞內滲透勢的平衡，從而有效降低鹽脅迫對沙芥幼苗造成的傷害［13］。針對沙芥上述耐鹽生理特征，Cui 等［14］采用轉錄組學手段對鹽脅迫下沙芥重要基因的差異表達情況進行了分析，并篩選了一批可能與沙芥耐鹽性相關的候選基因，但主要集中于鹽脅迫下沙芥體內離子吸收與轉運、活性氧清除系統等相關的功能基因，關于鹽脅迫下沙芥體內重要調控基因的表達變化目前仍未見報道。

在高鹽等逆境脅迫下，植物會接收并轉導脅迫信號，啟動體內對逆境脅迫的響應機制，進而調控下游相關功能基因對逆境脅迫的響應，其中蛋白激酶是上述信號轉導過程中的一類重要的調控蛋白［15-16］。眾多研究表明，在逆境脅迫下，植物通過膜受體蛋白激酶感知外界脅迫信號，隨后蛋白激酶發生蛋白磷酸化反應，使信號放大并向下傳導，進而激活下游的轉錄因子，以誘導相關抗逆基因的表達，從而增強植物的抗逆性［17］。鑒于此，本研究在已有的鹽處理（50 mmol·L-1NaCl）下沙芥轉錄組數據的基礎上［14］，分析了鹽處理下沙芥根和地上部中重要蛋白激酶編碼基因的差異表達情況，以期進一步揭示沙芥耐鹽性的相關分子機制，為農作物和優良牧草抗逆性遺傳改良提供重要的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料培養及轉錄組數據的獲得

沙芥種子采自寧夏石嘴山市沙芥種植園。選取成熟均一的種子先用75%酒精消毒30 s，再用5% NaClO 滅菌12 min，最后用蒸餾水清洗5 次，避光浸泡24 h。置于28 ℃培養箱中發芽，發芽后以石英砂作為培養基質，澆灌Hoagland 營養液培養［14］。隨后選取長勢良好且一致的4 周齡沙芥幼苗分別進行如下處理：1）對照處理（CK）：用正常Hoagland 營養液培養；2）50 mmol·L-1NaCl 處理：含有50 mmol·L-1NaCl 的Hoagland 溶液處理［14］。處理6和24 h 后分別取沙芥的根和地上部材料置于液氮中速凍，之后提取RNA 分別進行轉錄組測序，進而獲得了50 mmol·L-1NaCl 處理6 和24 h 后沙芥根和葉組織的轉錄組數據［14］。

1.2 蛋白激酶相關基因差異表達分析

利用Blastx 將已獲得的沙芥轉錄組數據［14］中的Unigene 與Swiss-Prot、NR、KEGG、COG 和GO 數據庫進行比對得到相應蛋白激酶基因的功能注釋。采用每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的reads（reads per kilobase of exon model per million mapped read，RPKM）的方法分析不同處理中沙芥根和地上部蛋白激酶相關基因的表達量［14，18-19］。參照Audic 等［20］的方法進行差異表達基因的篩選，并篩選鹽處理與對照間的差異表達基因，其中錯誤發現率（false discovery rate，FDR）≤0.001，且差異倍數在2 倍以上的基因即為差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）。

2 結果與分析

2.1 50 mmol·L-1 NaCl 處理下沙芥根中蛋白激酶相關基因表達分析

50 mmol·L-1NaCl 處理6 h 后，沙芥根中有18 個富亮氨酸重復類受體蛋白激酶（leucine rich repeat receptorlike kinases，LRR-RLKs）、1 個細胞壁連接的類受體激酶（wall associated kinase-like，WAK）、11 個促分裂原活化蛋白激酶級聯途徑（MAPK/MAPKK/MAPKKK）相關基因上調表達（圖1），其中6 個LRR-RLKs（CL2242.Contig2_All、CL797.Contig29_All、CL6717.Contig2_All、CL7990.Contig5_All、Unigene29560_All、CL1136.Contig10_All）、1 個WAK（CL807.Contig2_All）、2 個MAPK（CL1291.Contig1_All、CL2088.Contig2_All）編碼基因在對照處理下不表達，而在50 mmol·L-1NaCl 處理6 h 后的沙芥根中表達（表1），表明LRR 類受體蛋白激酶（LRR-RLK）、促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）可能參與調控沙芥根系對短期鹽脅迫的響應。

圖1 50 mmol·L-1 NaCl 處理6 和24 h 后沙芥根中蛋白激酶相關DEGsFig.1 Protein kinase-associated DEGs in root of P.cornutum under 50 mmol·L-1 NaCl for 6 and 24 h

此外，50 mmol·L-1NaCl 處理6 h 后，沙芥根中3 個增強抗病性因子（enhanced disease resistance 1，EDR1）、7個酪蛋白激酶（casein kinase，CK）、1 個糖原合成酶激酶（glycose synthase kinase 3，GSK3）和1 個蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）編碼基因顯著上調表達（圖1），其中有1 個EDR1（CL4341.Contig2_All）和1 個CK（CL1663.Contig1_All）在對照處理下不表達，而在50 mmol·L-1NaCl 處理6 h 后的沙芥根中上調表達（表1）；根中有9 個組成型三重反應基因（constitutive triple response 1，CTR1）顯著下調表達（圖1），其中，2 個CTR1（CL3516.Contig2_All、CL2980.Contig2_All）在對照處理下均有表達，而在50 mmol·L-1NaCl 處理6 h 后的沙芥根中均不表達（表2）。

表1 沙芥根中對照處理下不表達而50 mmol·L-1 NaCl 處理6 h 后表達的蛋白激酶相關基因Table 1 Genes related to protein kinase expressed in root of P.cornutum under 50 mmol·L-1 NaCl for 6 h but not expressed in root under control condition

表2 沙芥根中對照處理下表達而50 mmol·L-1 NaCl 處理下不表達的CTR1 編碼基因Table 2 Genes encoding CTR1 expressed in root of P.cornutum under control but not expressed under 50 mmol·L-1 NaCl treatment

50 mmol·L-1NaCl 處理24 h 后，沙芥根中有14 個LRR-RLKs、1 個WAK 編碼基因的表達顯著上調（圖1），其中3 個LRR-RLKs（CL797.Contig15_All、CL2242.Contig1_All、CL217.Contig3_All）編碼基因在對照處理下不表達，而在50 mmol·L-1NaCl 處理24 h 后的沙芥根中上調表達（表3）；雖然鈣依賴性蛋白激酶（calciumdependent protein kinase，CDPK）編碼基因下調表達的數目大于上調表達的數目，但有2 個CDPK（CL5176.Contig7_All、Unigene12783_All）在對照處理下不表達，而在50 mmol·L-1NaCl 處理24 h 后被顯著誘導（表3）。此外，50 mmol·L-1NaCl 處理24 h 后，沙芥根中有4 個CK、1 個GSK3 編碼基因的表達被顯著誘導，而8 個CTR1編碼基因下調表達（圖1），其中3 個CTR1（CL2548.Contig11_All、CL2980.Contig4_All、CL3385.Contig7_All）在對照處理下均有表達，而在50 mmol·L-1NaCl 處理24 h 后的沙芥根中不表達（表2）。此外，1 個CK（Unigene2819_All）在對照處理下不表達，而在50 mmol·L-1NaCl 處理24 h 后沙芥根中高豐度表達（表3）。

表3 沙芥根中對照處理下不表達而50 mmol·L-1 NaCl 處理24 h 后表達的蛋白激酶相關基因Table 3 Genes related to protein kinase expressed in root of P.cornutum under 50 mmol·L-1 NaCl for 24 h but not expressed in root under control condition

進一步分析表明，50 mmol·L-1NaCl 處理6 和24 h 后沙芥根中有6 個CTR1（CL2548.Contig6_All、CL101.Contig3_All、CL4149.Contig6_All、CL70.Contig 23_All、CL3225.Contig5_All、CL7357.Contig2_All）編 碼基因均下調表達，1 個LRR-RLK（Unigene29671_All）編碼基因顯著上調表達（表4）。

表4 50 mmol·L-1 NaCl 處理6 和24 h 后沙芥根中均上調或下調表達的蛋白激酶相關DEGsTable 4 Protein kinase-associated DEGs that were upregulated or down-regulated in root of P.cornutum under 50 mmol·L-1 NaCl for both 6 and 24 h

2.2 50 mmol·L-1 NaCl 處理下沙芥地上部蛋白激酶相關基因表達分析

50 mmol·L-1NaCl 處理6 h 后，沙芥地上部有13個LRR-RLKs、2 個WAK、8 個CDPK 編碼基因的表達顯著上調（圖2），其中4 個LRR-RLKs（CL8787.Contig2_All、CL8721.Contig3_All、CL7704.Contig2_All、CL4552.Contig2_All）、1 個 WAK （CL807.Contig2_All）、4 個CDPK（CL707.Contig1_All、CL5176.Contig7_All、CL1773.Contig18_All、CL4470.Contig2_All）編碼基因在對照處理下不表達，而在50 mmol·L-1NaCl 處理6 h 后的沙芥地上部中表達（表5）；雖然MAPK/MAPKK/MAPKKK 中下調表達的數目大于上調表達的數目，但有2 個MAPK（CL10.Contig5_All、Unigene7805_All）、1 個MAPKK（CL3832.Contig4_All）在對照處理下不表達，而在50 mmol·L-1NaCl 處理6 h后被顯著誘導（表5）。此外，50 mmol·L-1NaCl 處理6 h 后，沙芥地上部有1 個CTR1 編碼基因下調表達，6 個EDR1、5 個CK、1 個PKC 編碼基因的表達被顯著誘導（圖2），其中2 個EDR1（CL5872.Contig4_All、CL4341.Contig2_All）、3 個CK（CL1663.Contig1_All、Unigene16644_All、Unigene9975_All）在對照處理下不表達，而在50 mmol·L-1NaCl 處理6 h 后被顯著誘導（表5）。

表5 沙芥地上部對照處理下不表達而在50 mmol·L-1 NaCl 處理6 h 后表達的蛋白激酶相關基因Table 5 Genes related to protein kinase expressed in shoot of P.cornutum under 50 mmol·L-1 NaCl for 6 h but not expressed in shoot under control condition

圖2 50 mmol·L-1 NaCl 處理6 和24 h 后沙芥地上部蛋白激酶相關DEGsFig.2 Protein kinase-associated DEGs in shoot of P.cornutum under 50 mmol·L-1 NaCl for 6 and 24 h

50 mmol·L-1NaCl 處理24 h 后，沙芥地上部有3 個CTR1 編碼基因下調表達，2 個EDR1 編碼基因的 表達顯著上調（圖2），1 個EDR1（CL1578.Contig1_All）編碼基因在對照處理下不表達，而在50 mmol·L-1NaCl 處理24 h 后的沙芥地上部中上調表達（表6）。此外，50 mmol·L-1NaCl 處理24 h 后，雖然沙芥地上部LRR-RLK 編碼基因中下調表達的數目大于上調表達的數目，CDPK 編碼基因中上調表達數目與下調表達數目相同，但有4 個LRR-RLKs（CL3884.Contig5_All、CL4661.Contig4_All、CL3235.Contig3_All、CL4047.Contig1_All）、2 個CDPK（CL707.Contig1_All、CL1773.Contig18_All）在對照處理下不表達，而在50 mmol·L-1NaCl 處理24 h 后被顯著誘導（表6）。

表6 沙芥地上部對照處理下不表達而50 mmol·L-1 NaCl 處理24 h 后表達的蛋白激酶相關基因Table 6 Genes related to protein kinase expressed in shoot of P.cornutum under 50 mmol·L-1 NaCl for 24 h but not expressed in shoot under control condition

進一步比較分析發現，50 mmol·L-1NaCl 處理6和24 h 后沙芥地上部有5 個LRR-RLKs（CL797.Contig29_All、CL8787.Contig2_All、CL4552.Contig2_All、CL3884.Contig6_All、CL8721.Contig3_All）、1 個CDPK（CL1773.Contig18_All）、1 個CK（CL5415.Contig8_All）和1 個EDR1（CL1578.Contig8_All）編碼基因均上調表達，1 個CTR1（CL3385.Contig7_All）編碼基因下調表達（表7）。

表7 50 mmol·L-1 NaCl 處理6 和24 h 后沙芥地上部中均上調或下調表達的蛋白激酶相關DEGsTable 7 Protein kinase-related DEGs that were up-regulated or down-regulated in shoot of P.cornutum under 50 mmol·L-1 NaCl for both 6 and 24 h

3 討論

沙芥具有較強的耐鹽性，蘊涵著豐富抗逆基因資源［13，21］。已有研究從離子吸收與轉運、活性氧清除系統等方面分析了鹽處理下沙芥體內的差異表達基因，篩選了一批可能與沙芥耐鹽性相關的候選基因［14］。本研究系統分析了鹽處理下沙芥根和地上部蛋白激酶相關基因的差異表達，發現50 mmol·L-1NaCl 處理下沙芥根和地上部眾多參與調控植物逆境響應的蛋白激酶編碼基因的表達發生顯著變化，主要包括LRRRLKs、MAPK/MAPKK/MAPKKK 及CTR1 等編碼基因。

研究表明，LRR-RLKs 在植物耐鹽性中發揮著重要的調控作用［15］。鹽脅迫下蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）LRR-RLKs 成員Srlk 編碼基因快速上調表達，通過調控植株根系的生長發育以調節植物的耐鹽性［22］。馬鈴薯（Solanum tuberosum）StLRPK1通過參與調控水楊酸、茉莉酸、脫落酸等信號通路，從而調控植株對鹽脅迫等多種逆境的響應［23］。黃絲瓜蘚（Pohlia nutans）PnLRR-RLK基因在擬南芥中的超表達可通過提高AtHKT1、AtSOS3、AtP5CS1和AtADH1等耐鹽相關關鍵基因的表達，從而增強植株的耐鹽性［24］。本研究發現，50 mmol·L-1NaCl 處理6 和24 h 后，沙芥根中分別有18 和14 個LRR-RLKs 編碼基因的表達顯著上調，其中，分別有6 和3 個在沙芥根中對照處理下不表達而在50 mmol·L-1NaCl 處理6 和24 h 后均表達的蛋白激酶相關基因。而在地上部中，50 mmol·L-1NaCl 處理6 和24 h 后，各有13 個LRR-RLK 基因的表達顯著上調，其中，各有4 個LRR-RLK 基因在對照處理下沙芥地上部不表達而在50 mmol·L-1NaCl 處理6 和24 h 后表達，且有5 個LRRRLKs 在50 mmol·L-1NaCl 處理6 和24 h 后沙芥地上部中均上調表達。上述LRR-RLKs 可能在沙芥適應鹽脅迫過程中發揮著重要作用。

MAPK 家族是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的一個大家族，家族成員包括MAPK、MAPKK 和MAPKKK 3 種類型，它們通過MAPKKK→MAPKK→MAPK 逐級磷酸化將外來信號級聯放大，激活下游相關基因的表達并啟動相應的生理生化反應［17］。研究表明，MAPK/MAPKK/MAPKKK 蛋白激酶也參與調控植物對鹽脅迫的應答［17］。如研究發現，在鹽脅迫下超表達黃瓜（Cucumis sativus）CsNMAPK的轉基因煙草（Nicotiana tabacum）種子的萌發率要明顯高于野生型［25］。玉米（Zea mays）MAPK 家族基因ZmMKK4超表達能通過增加植株體內脯氨酸和可溶性糖含量、提高POD 和CAT 酶的活性，進而顯著提高擬南芥的耐鹽性［26］。毛果楊（Populus trichocarpa）MAPK家族成員PtMAPKK4 編碼基因的超表達亦可顯著增強煙草的耐鹽性［27］。在本研究中，50 mmol·L-1NaCl 處理6 h 后沙芥根中共有11 個MAPK/MAPKK/MAPKKK 蛋白激酶基因的表達顯著上調，據此可以推測，MAPK/MAPKK/MAPKKK 家族蛋白可能參與調控沙芥對鹽脅迫的早期響應過程。

除眾多蛋白激酶正向調控植物抗逆性外，還有一些蛋白激酶家族負向調控逆境響應，其中CTR1 是植物耐鹽信號傳導途徑的一類負調控因子［16，28］。在模式植物擬南芥的研究中發現，與野生型相比，鹽脅迫下ctr1突變體地上部Na+濃度顯著降低而K+濃度顯著增加，導致ctr1突變體地上部具有較高的K+/Na+比，從而使得ctr1突變體對鹽脅迫的耐受性顯著強于野生型植株［29-31］。秘彩莉等［28］將小麥（Triticum aestivum）中的TaCTR1基因在煙草中超表達后，發現轉基因植株的耐鹽能力明顯弱于野生型植株。本研究發現，50 mmol·L-1NaCl 處理下沙芥根中多個CTR1 類蛋白激酶編碼基因均下調表達，特別是50 mmol·L-1NaCl 處理6 和24 h 后根中有6 個CTR1 編碼基因的表達均顯著下調，可以推測，上述CTR1 可能在沙芥根系響應短期鹽脅迫過程中發揮著重要的負調控作用。

4 結論

基于已有沙芥轉錄組數據分析了鹽處理下沙芥根和地上部蛋白激酶相關基因的差異表達情況，篩選了可能參與調控沙芥耐鹽性的重要蛋白激酶。其中，富亮氨酸重復類受體蛋白激酶（LRR-RLKs）在沙芥適應鹽脅迫過程中可能發揮著重要調控作用，促分裂原活化蛋白激酶級聯途徑（MAPK/MAPKK/MAPKKK）信號通路可能在沙芥響應短期鹽脅迫過程中發揮關鍵作用，乙烯信號轉導途徑中重要負調控因子CTR1 可能在沙芥根系響應鹽脅迫過程中發揮負調控功能。