水產品中冰晶重結晶機理及控制方法的研究進展

譚明堂，王金鋒，謝 晶,4,

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術服務平臺，上海 201306；4.食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306）

冷凍由于能夠延長水產品貨架期且維持其高品質，在很早之前就已用于水產品的貯藏保鮮。根據農業(yè)農村部漁業(yè)漁政局數據顯示，2019年中國水產品總產量達到6 480.36萬 t，其中冷凍水產品總量達到1 532.27萬 t[1]。在冷凍過程中，水產品中的部分水由于相變而轉變成冰晶[2]。凍結水含量主要取決于冷凍溫度和產品本身的成分[3]。然而，在冷凍過程中，形成的冰晶會嚴重影響水產品細胞的完整性，從而導致其品質的下降[4]。眾所周知，冰晶的大小、形態(tài)和分布與冷凍速率息息相關[5-6]。另外，冷凍水產品在冷凍、凍藏、運輸和凍融過程中都有可能發(fā)生冰晶的重結晶[7]，而冰晶重結晶會改變水產品中冰晶的大小及分布[8]。溫度的波動會促使冰晶發(fā)生溶解再結晶，加劇對產品品質的影響[9-10]。因此，如何控制冰晶的重結晶、抑制冰晶的生長、延緩水產品品質的下降是冷凍保鮮的重點研究方向之一。

目前，添加抗凍劑是緩解冰晶重結晶的重要方法。最常用的抗凍劑有二甲基亞砜[11]、甘油[12]、1,2-丙二醇[13]和具有冰重結晶抑制（ice recrystallization inhibition，IRI）活性的聚合物，比如聚乙烯醇和聚乙二醇[14]等。但是，在食品中使用這些抗凍劑時就必須評估其可能的安全風險[13]。近年來，糖類物質作為抗凍劑已被廣泛應用于冷凍水產品的加工中[15]。而且抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）作為從天然環(huán)境中提取的活性蛋白，其能夠依附在冰晶上，從而抑制冰晶的重結晶。目前國內外針對水產品中冰晶重結晶的研究缺乏系統性的概括和分析。因此，本文總結了近年來在此領域的最新研究進展，綜述了水產品中冰晶重結晶的機理及其控制方法，以期為研發(fā)抑制水產品中冰晶重結晶的方法，維持冷凍產品的高品質提供理論依據。

1 冰晶重結晶的機制

冰晶形成之后，任何冰晶體的形狀、大小、數量或者其他變化過程均可稱為冰晶重結晶[16]。重結晶的表現為小冰晶聚集形成大冰晶、晶體的平均尺寸增加、晶核數減少、晶體的總表面自由能降低[17]。驅動水產品中冰晶重結晶主要有3 種機制：積聚、遷移和表面等滲[18]，具體見圖1。積聚主要發(fā)生在重結晶的早期階段，相鄰區(qū)域的晶體容易融合形成較大的晶體[4]。遷移性重結晶也被稱為奧斯特瓦爾德熟化，在溫度變化影響下，小冰晶先融化且產生的液體遷移到大冰晶表面，最終導致小冰晶的消失、大冰晶的生長。目前已知影響遷移性重結晶的因素主要有溫度和水的擴散率[17]。冷凍溫度越低，水分子的遷移速度越慢，水分子越難聚集在大冰晶上[4]。在表面等滲重結晶過程中，晶體系統趨向于熱力學穩(wěn)定狀態(tài)，粗糙表面的晶體在變得光滑后又會趨向于銳利形態(tài)[16]。

圖1 冰晶重結晶的3 種機制（積聚、遷移和表面等滲）[4]Fig. 1 Three mechanisms of ice recrystallization (accretion, migration,and surface isomass)[4]

2 重結晶對水產品品質的影響

在凍藏和運輸過程中往往會出現溫度波動。溫度波動會導致冰晶的尺寸、分布和形狀發(fā)生改變，從而加大對水產品的機械損傷，降低其品質。有研究表明，溫度波動（－18～4 ℃和－18～－80 ℃）均會導致形成更大的冰晶（表面積增加）和不規(guī)則的冰晶（圓度降低），加劇肌纖維斷裂，對蝦仁的肌肉組織造成不可逆的機械損傷，且在相同波動次數情況下，－18～4 ℃比－18～－80 ℃對樣品造成的損傷更大[9,19]。溫度波動也會影響鯰魚魚片的解凍損失、脂肪水解和氧化[10]。

在冷凍過程中水會從肌纖維內部往外部遷移，最后形成的大冰晶對肌纖維的損傷較大，影響解凍后肌纖維對水的重吸收能力[20]。蝦仁在經歷溫度波動后，其持水能力明顯降低，這可能與冰晶對肌纖維的破壞和蛋白質變性有關[9]。此外，由凍融循環(huán)引起的溫度波動對肌纖維的保水能力和表面疏水性影響更大[21]。在凍融循環(huán)過程中，冰晶會反復融化和形成，這大大增加了冰晶對羅非魚肌纖維的機械損傷，大大削弱其持水能力[22]。因此，為了延緩水產品水分的流失和質量的降低，應控制溫度波動對水產品重結晶的影響。此外，與小冰晶相比，樣品中的大冰晶對水蒸氣流動的抵抗力較小，表面水分蒸發(fā)后會留下較大的孔，易促進在凍藏期間樣品與外界環(huán)境的傳熱、傳質，增強水產品的干耗[23]，因此需特別注意在凍藏過程中冰晶的重結晶對水產品干耗的影響。

溫度波動除了對水產品的汁液損失影響較大外，也會促進蛋白質和脂質的氧化[24]。這可能是由于在凍藏期間溫度波動會導致冰晶長大，加劇對肌肉細胞的破壞，導致線粒體、溶酶體酶、血紅素鐵等其他促氧化劑的釋放，促進蛋白質和脂質的氧化反應[25]。冰晶對肌肉組織的破壞同樣也會影響蛋白質的結構和含量[19]。

水產品的質構和顏色是影響消費者評價品質最直觀的因素。有研究表明，與內源蛋白水解酶活性和蛋白質、脂肪氧化相比，冰晶對冷凍貯藏過程中的魚類質構的劣變影響最大，這種劣變主要發(fā)生在凍藏前期[26]。另外，溫度的波動使冰晶尺寸變大，加劇質構方面的劣變，這可能是由于大冰晶的機械損傷導致水產品結締組織的機械強度降低、水分流失和蛋白質聚集[19]。隨著冷凍三文魚表層冰晶尺寸的增大，其L*值減小，a*和b*值增大，產品表面呈現較深的顏色[27]。因此，為防止冰晶重結晶對水產品品質產生負面影響，應盡量避免冷凍、運輸和凍藏過程中的溫度波動。

3 冰晶重結晶抑制劑

為了抑制冰晶重結晶對水產品質量產生的不利影響，除了控制凍品溫度的升高和溫度波動外，目前傾向于往水產品中加入冰重結晶抑制劑，例如糖類、AFPs、抗凍肽和具有IRI活性的聚合物等。

3.1 糖類

糖類物質作為一種抑制冰晶重結晶物質，目前已被廣泛應用于冷凍水產品中。Zhang Mingke等[28]研究了4 種二糖（蔗糖、海藻糖、麥芽糖和乳糖）對濃甘油水溶液冰晶成核和生長的影響，結果發(fā)現蔗糖在抑制冰晶成核和生長上的效果最佳。但是，Klinmalai等[29]卻發(fā)現相較于蔗糖，海藻糖的過冷度更高，生成的冰晶更細小，且因水遷移率低，有更低的冰晶重結晶速率。目前社會追求的是低糖、低熱的消費趨勢[30]。因此，研究人員在運用糖類抑制水產品的冰晶重結晶時，更傾向于選擇低甜度的糖類。

與 磷酸鹽Na4P2O7相比，用低甜度和低熱量的海藻糖和藻酸鹽低聚糖浸泡能夠更好地抑制在溫度波動時蝦仁中冰晶的生長和重結晶，這對于改善蝦仁的持水能力，減緩冷凍誘導的蛋白質變性，降低冰晶對蝦肌肉組織的損害十分有利[9]。研究人員分別對k-角叉菜膠和l-角叉菜膠的IRI活性和熱滯（thermal hysteresis，TH）活性（熔點和凝固點之間的溫度差）進行測試，結果顯示這兩種糖類都具有IRI活性且k-角叉菜膠的IRI活性比l-角叉菜膠更高，但都不具有TH活性[31]。Zhang Bin等[19]分別k-角叉菜寡糖和木寡糖浸泡過蝦仁，發(fā)現這兩種糖都具有比Na4P2O7更好的抑制冷凍去皮蝦冰晶重結晶的能力。由于k-角叉菜膠分子本身容易聚集在一起具有凝膠特性而降低了對冰重結晶的抑制能力。通常鹽的加入可促進k-角叉菜膠分子凝膠化，但是NaI的加入可防止k-角叉菜膠分子聚集在一起，對IRI活性沒有影響[32]。關于糖類物質對于冰生長機制的研究，Zhang Bin等[25,33]認為糖分子通過氫鍵、疏水或靜電的相互作用與冰晶結合會影響肌肉蛋白質周圍水分子的分布及其遷移，從而降低冰晶重結晶發(fā)生的概率。糖類對于冰晶的作用機制目前僅通過分子動力學模擬，還缺少實驗的支撐。

糖醇一般由糖類制備，含有兩個以上的羥基，已被作為冰重結晶抑制劑用于冷凍水產品的加工。在蝦仁凍藏過程中，冰晶仍在不斷生長，而添加木糖醇、異麥芽糖醇及甘露糖醇后可有效抑制其冰晶的重結晶，這可能是因為糖醇分子中的羥基通過束縛其周圍水分子，減緩冰晶生長速率，抑制冰重結晶，降低對組織的機械損傷[34]。同樣，甘露醇和木糖醇對南美白對蝦的冰晶生長也有較好的抑制作用[35]。山梨糖醇中的羥基可通過氫鍵與水相結合，抑制水產品中冰晶的生成，起到較好的抑制冰重結晶作用[36]。此外，糖類分子中羥基數目越多，抑制冰晶重結晶的效果越好[15]。為了更好地抑制冰晶重結晶，還可以將糖類與其他抗凍劑結合使用。與淡水處理組相比，木糖醇、殼聚糖、海藻酸鈉、氯化鈉和三聚磷酸鈉的復配溶液可以更好地抑制小龍蝦的冰晶形成和生長，并且在復配液浸泡小龍蝦時使用超聲處理能夠更好地維持樣品的品質[37]。Solocinski等[11]研究了海藻糖和二甲基亞砜（Me2SO）溶液對冰晶生成、細胞活力和代謝的影響，結果顯示二甲基亞砜可以進入細胞內對細胞內冰晶發(fā)揮作用，而海藻糖由于無法進入細胞內僅對細胞外冰晶的生成發(fā)揮作用，因此這兩者抗凍劑的結合能夠同時對細胞內外的冰晶起到抑制作用。這可為未來抑制水產品冰晶重結晶提供新思路。關于糖類對于冰晶重結晶抑制的理論仍停留在假設階段，未來需進一步深入探索。

3.2 抗凍蛋白

最早對AFPs的研究可追溯至1969年，從南極魚體內發(fā)現存在AFPs物質，其能防止體液凍結[38]。AFPs通過結合到冰晶表面來降低冰晶的凝固點，抑制冰晶生長[39]。AFPs除了具有TH活性，抑制冰晶形成外，還具有IRI活性，起到抑制冰晶重結晶的作用[40]。通常，AFPs的IRI活性越高，可以形成的冰晶越小[38]。雖然，AFPs的IRI和TH能力是通過吸附在冰晶表面表現出抗凍性和避免冷凍，但是同一物種中IRI和TH之間似乎并沒有明顯的相關性[41]。

目前AFPs在抑制水產品的冰晶重結晶方面已有研究。AFPs也被稱為冰結構蛋白（ice structuring proteins，ISPs）或冰結合蛋白（ice binding proteins，IBPs）[15]。ISPs可以起到抑制冰晶長大、改變冰晶形態(tài)、抑制重結晶發(fā)生、維持細胞完整性并減少組織損傷、提高凍融過程鯉魚肌原纖維蛋白結構穩(wěn)定性的作用[42]。同時，ISPs還可以有效地抑制鯉魚在凍融循環(huán)周期的水分遷移和因冰晶重結晶對其微結構破壞和蛋白質、脂質氧化[43]。Nian Linyu等[44]從鯡魚體內提取得到的AFPs通過與冰晶結合來降低冰點，從而抑制冰晶的形成，并且可以抑制因凍融循環(huán)引起的重結晶以保護大嘴鱸魚免受冰晶損傷，維持產品的品質。由于AFPs溶液的分散性差，殼聚糖磁性納米粒子的加入可以改善系統的穩(wěn)定性和均勻性[45]。鯡魚AFPs和殼聚糖磁性納米粒子通過真空浸漬結合可以抑制紅鯛魚的冰晶生長，以及有助于抑制其蛋白質氧化和聚集[46]。生物體的AFPs抗凍活性容易受到環(huán)境的影響，比如溫度、季節(jié)和晝夜節(jié)律等[38]。為了增強AFPs的IRI活性，可以通過控制AFPs與冰晶之間的吸附性實現。在冷凍保存過程中，添加鈉鹽可以增強AFPs的IRI活性[47]。化學陽離子修飾的AFP III可以提高其熱穩(wěn)定性，增強在高溫下的抗變性能力，同時與天然AFP III相比，不會影響其IRI活性[48]。雖然AFPs具有極佳的IRI活性，但是由于AFPs在提取、純化和合成等相關高成本的限制，在工業(yè)生產中很難像糖類一樣大規(guī)模運用。

3.3 抗凍肽

AFPs的提取主要來源于在高寒、高海拔等極端環(huán)境下的生物體，比如魚、昆蟲、細菌和植物等。而抗凍肽的制備主要是通過蛋白酶解從食源性蛋白源獲得[7]?？箖鲭哪軌蚪鉀Q天然AFPs存在的大規(guī)模純化等問題?？箖鲭木哂蓄愃艫FPs的作用，能夠在極低濃度下有效抑制冰重結晶的能力[49]。比如利用堿性蛋白酶從豬膠原蛋白提取的抗凍肽具有TH活性，能夠改善冰淇淋的重結晶[50]。雖然雞膠原蛋白肽的冰晶抑制能力不如I型AFP，但是其仍然具有良好的低溫保護活性，這可為抑制水產品冰晶方法提供一個選項。蔗糖溶液經歷溫度波動（－16～－12 ℃）后，添加質量濃度為1 mg/mL的雞膠原蛋白肽可使冰晶大小降低70%[51]。雖然抗凍肽已用于抑制食品中冰晶的重結晶，例如櫻桃[52]、冷凍面團[53]和冰淇凌[54]等，但是在冷凍水產品方面的文獻較少。李曉坤[55]在魚糜中添加了不同量的抗凍肽（2%、4%、8%，以魚糜質量計，下同）和8%商業(yè)抗凍劑，結果發(fā)現抗凍肽能夠有效抑制蛋白質的冷凍變性、冰晶的生長，且低溫保護效果由高到低為：8%抗凍肽＞4%抗凍肽＞8%商業(yè)抗凍劑＞2%抗凍肽，添加量越高，對冰晶的抑制越好，但是選擇添加量時應同時考慮效能和經濟性。未來需要進一步探索抗凍肽在抑制水產品重結晶方面的應用，為其廣泛應用提供理論研究依據。

3.4 具有IRI的聚合物

除了糖類和AFPs有IRI活性，一些聚合物也能夠抑制冰晶重結晶。聚合物的IRI活性雖然遠不如天然抗凍劑，但是它的活性可以滿足冷凍保存的效果，且由于價廉易得而顯得更加重要[56]。眾所周知，聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）是一種水溶性合成聚合物，它的合成仿制AFPs的作用原理，可以有效抑制冰的重結晶[57]。研究人員通過分子動力學模擬研究發(fā)現，PVA上的羥基通過與水分子上的氫鍵相連而結合到冰晶表面[58]。同時PVA還會降低水分子之間的氫鍵數，導致體系中游離水的減少，成核溫度和結晶潛熱降低，從而抑制冰晶的結晶[59]。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）與PVA類似，也具有IRI活性，能夠抑制冰晶的重結晶[56]。此外，Mitchell等[14]發(fā)現聚合物PVA和PEG混合使用后的IRI活性更高。

納米纖維素依據微觀形態(tài)的不同分為纖維素納米微纖絲（cellulose nanofibrils，CNFs）和纖維素納米微晶（cellulose nanocrystals，CNCs）[60]。由于納米纖維素具有生物降解性、低密度、高表面積和柔韌性而廣受關注，被廣泛用于增強劑、乳液穩(wěn)定劑、阻隔膜和黏合劑等方面[61]。在2019年，Li Teng等[62]首次發(fā)現納米纖維素具有IRI活性。在0.01 mol/L NaCl和磷酸緩鹽沖液中加入納米纖維素后，發(fā)現其起到了抑制冰晶生長的作用，同時與對照組（PEG）相比，在納米纖維素中觀察到較小的冰晶，這表明所用的CNFs和CNCs都具有IRI活性。但是Velásquez-Cock等[63]卻發(fā)現CNFs對冰淇淋冰晶的生長沒影響，這可能是因為CNFs的制備方法有差異。為了增強納米纖維素的IRI活性，需對納米纖維素的兩個最重要的結構參數——表面電荷密度（surface charge density，SCD）和原纖維長度進行研究。當CNCs的原纖維不聚集時，通過降低其SCD使IRI活性增加，SCD較低的CNF也具有較高的IRI活性，且通過降低pH值使得CNFs的羧酸根質子化也可增強其IRI活性[64]。超聲處理可以降低原纖維的聚集和長度，在超聲30 min內主要破壞原纖維的聚集而使得IRI活性增強，而更長的超聲處理時間會縮短原纖維的長度，導致IRI活性降低[65]。Zhou Ting等[66]發(fā)現PVA/CNFs氣凝膠具有良好的隔熱性能和低密度，未來可將其制備成膜包裹在水產品表面，減緩因凍藏過程中出現的短暫溫度波動對水產品冰晶重結晶的影響。雖然PVA和納米纖維素都已證實具有IRI活性，但是以何種方式應用于冷凍水產品冰晶重結晶的抑制需深入探索。

3.5 其他重結晶抑制劑

甘油又名丙三醇，具有兩個一級羥基和一個二級羥基，是最簡單的三元醇，可與水完全混溶，其可起到抑制冰晶生長的作用[12]。但是，甘油用在抑制水產品冰晶生長中需要高濃度，這會增加毒性，同時也可能對產品的外觀和氣味造成影響。最近有研究表明氧化石墨烯是一種高IRI活性和低TH活性的材料，能很好地抑制冰晶的生長和重結晶，且在抑制馬精子的冰晶生長時效果比甘油好，但不如PVA和AFPs[67]。氧化石墨烯會優(yōu)先吸附在冰晶表面，由于吉布斯-湯普森效應，其通過使冰晶表面發(fā)生彎曲，從而抑制冰晶的生長[68]。但是氧化石墨烯還未發(fā)現在食品研究領域有報道，需要關注氧化石墨烯的使用是否會對水產品有其他影響。

4 結 語

冷凍水產品在凍結、運輸和凍藏過程中無法避免冰晶重結晶的發(fā)生。而重結晶會導致冰晶形態(tài)改變，對水產品的肌纖維造成不可逆的機械損傷，導致汁液流失加快，蛋白質和脂質氧化以及水產品質構、表面顏色等品質的劣化等。目前重結晶對水產品品質的影響僅簡單歸結于冰晶大小和形態(tài)，應該深入探索各個品質指標與冰晶的變化是否直接相關。添加冰重結晶抑制劑是解決冰重結晶對水產品品質影響的有效途徑。糖類物質已被廣泛運用于水產品的冰晶重結晶中，目前對于其作用機理僅通過分子動力學來分析，還缺少實驗的驗證。AFPs由于其提純的高成本目前無法廣泛應用，而抗凍肽具有AFPs類似的功能且可通過酶切法大量獲得。未來應對抗凍肽在水產品中的應用需進一步探索。根據AFPs對冰晶抑制的機理，已發(fā)現了眾多具有IRI活性的聚合物，但是目前在抑制水產品冰晶重結晶方面的報道較少。另外，還應關注聚合物在用于水產品后的殘留是否有安全問題。對水產品中冰晶重結晶的機理及控制方法的綜述，不僅有助于人們對冰晶重結晶最新現狀的了解，還能夠為提升冷凍水產品質量提供參考意見。