乳及乳制品中磷脂的含量、功能、分離及檢測技術研究進展

胡 雪，段國霞，劉麗君，李翠枝，呂志勇，唐 爍

（內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010110）

磷脂是一類含有磷酸基團的脂質，其廣泛存在于植物油、大豆、蛋黃、乳制品、肉類中[1-2]。磷脂也是一類被熟知的極性脂類，根據其主體碳鏈結構的不同，可主要分為甘油磷脂和鞘磷脂兩大類[3-4]。甘油磷脂主要包含了磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS），鞘磷脂則主要為神經鞘磷脂（sphingomyelin，SM）。除了以上常見的5 種磷脂外，學者們還發現了一些微量磷脂成分，如磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE）、縮醛磷脂、葡糖神經酰胺（glucoceramide，GluCer）和乳糖神經酰胺（lactose ceramide，LacCer），其中GluCer和LacCer都屬于鞘磷脂，LPC和LPE分別為PC和PE的代謝產物[5-8]。磷脂在乳中的存在形式為乳脂肪球滴，是乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）的主要組成物質，由于其兩親性特征，磷脂在乳中起到了維持乳脂物理穩定性的作用，也通常被用作乳化劑添加到食品中[9-11]。磷脂種類繁多，因擁有多種同分異構體和異形物，使得其檢測方法異常復雜。目前，GB 5009.272—2016《食品安全國家標準 食品中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的測定》闡述了使用紫外檢測器測量食品中PC、PE和PI的方法，GB/T 35867—2018《糧油檢測 卵磷脂中磷脂含量的測定》高效液相色譜蒸發光散射檢測法和ISO 11701-2009Vegetable fats and oils-Determination of phospholipids content in lecithins by HPLC using a light-scattering detector闡述了使用蒸發光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELSD）測定卵磷脂中磷脂含量的方法。然而，以上標準的適用范圍為大豆磷脂、大豆油、花生油等基質，并不包含乳及乳制品。國外有部分學者對食品包括乳品中磷脂的含量、分布和檢測手段發表了一些綜述[7-10]，但檢測技術的發展日新月異，文獻報道往往具有其時限性；國內就此領域發表的相關報道不多，針對乳制品基質的更是少之又少。基于以上事實，本文就最近20 年（2000—2020年）發表的關于乳及乳制品中磷脂分布、含量、功能性、分離提取、檢測手段的相關學術報道進行了細致而全面的綜述，以期為相關檢測行業提供技術參考。近年來，眾多嬰幼兒食品企業已將磷脂作為營養強化劑添加入配方乳粉中，但磷脂成分標識缺乏完整的信息，且國內外針對乳制品中磷脂含量的相關檢驗標準仍未頒布，其含量與標識值是否一致也無從驗證。因此，梳理和總結乳及乳制品中磷脂類化合物的檢測手段對乳制品行業具有一定的現實意義。

1 乳及乳制品中磷脂的含量

1.1 母乳中磷脂的含量

隨著近年來分析化學的發展，母乳中磷脂的含量和組成被來自中國、西班牙、法國、新加坡和馬來西亞等國家的科研團隊報道。概括來說，磷脂在母乳中的質量濃度為13.3～40.6 mg/100 mL，占乳脂的比例為0.4%～1.4%[12-17]，各組分所占比例為PC：16.8%～28.5%；PE：9.3%～40.0%；SM：24.0%～45.9%；PI：2.0%～9.5%；PS：2.6%～16.7%。可以看出；母乳中含量最多的磷脂為SM；其次為PE和PC。多篇文獻指出母乳中磷脂含量會隨著母親所處的泌乳階段、飲食習慣和所處地區發生顯著改變，一些研究人員對母親在不同泌乳時期（初乳期、過度乳期、成熟乳期）所產乳中磷脂含量的變化進行了研究[17-20]，其中Ma Lin等[18]的結果顯示初乳、過度乳和成熟乳中磷脂總量分別為32.7、26.3、21.5 mg/100 g，表明乳中磷脂含量會隨著泌乳時間的遞增而呈遞減趨勢；而母親的年齡通常不是影響母乳中磷脂含量的顯著因素，但早產兒母親所產的乳中磷脂含量會比足月兒更低[20]。來自不同國家的母親所產乳中磷脂含量也存在顯著差異，這主要是由各自不同的飲食習慣所引起的。例如，日本的母親長期以來有著攝入大量海產品的飲食習慣，她們所產的母乳中可能含有更高的PE，因為深海魚蝦中富含多種組成該類磷脂的不飽和脂肪酸；而來自中國的母親會在生產后的第一個月補充大量的雞蛋、魚類和其他肉類食品，俗稱“坐月子”，她們所產的母乳中可能也會含有較高的PE，因為雞蛋中富含PE[21]。

1.2 牛乳中磷脂的含量

近年來也有諸多文獻對牛乳中磷脂的含量和分布進行了分析和總結。通常，磷脂在牛乳中的質量濃度為4.6～49.1 mg/100 mL，其在乳脂中的相對含量為0.2%～1%[22]，其各組分相對含量為PC：19.1%～36.6%，PE：22.6%～42.0%，SM：17.0%～41.1%，PI：2.9%～9.3%，PS：1.7%～10.5%。與母乳不同的是，牛乳中含量最多的磷脂是PE，其次是SM和PC。一般認為導致牛乳中磷脂含量差異的因素包括品種、年齡、季節、地域、飼料配比、泌乳階段、飼養模式和加工工藝等。飼料一般是造成牛乳中磷脂差異的最主要因素，調整飼料配比（如添加精飼料或含油種子）會造成牛乳中不飽和脂肪酸比例的改變，從而引起部分磷脂分子種類的改變[23-25]。牛品種也可能影響乳中磷脂指標，如Bitman[26]和Graves[27]等對比了娟姍牛和荷斯坦牛所產乳中磷脂的含量差異，Bitman等指出荷斯坦牛所產乳中磷脂含量更高，而娟姍牛所產乳中甘油三酯含量更高[26]，Graves等則進一步研究了造成這種差異的原因，指出這是因為荷斯坦牛的乳脂肪球體積更小，具有更大的球膜表面積，因此含有更多的磷脂[27]。除此之外，經過滅菌工藝處理的牛乳，其磷脂含量會比生牛乳低，如Rombaut等[8]測得生牛乳中的磷脂總含量為29.4 mg/100 g，經過巴氏殺菌和超高溫瞬時滅菌（ultrahigh temperature instantaneous sterilization，UHT）工藝處理后的牛乳分別含18.8 mg/100 g和21.2 mg/100 g磷脂，一個潛在因素可能是高溫造成不飽和脂肪酸改變而引發磷脂含量的差異；Reis等[28]在其實驗中也驗證了這一點，當熱處理過程中溫度設定為80 ℃時，PC（28∶0）和PE（36∶1）含量發生顯著下降，作者認為是磷脂在高溫下發生糖化和降解導致的。其他因素如飼養模式也會影響牛乳中磷脂的含量，Avalli[29]和Donato[30]等對意大利地區不同牧場的牛乳進行了磷脂含量檢測，二者檢測的牛乳中磷脂總量分別為9.3 mg/100 g和4.6 mg/100 mL，原因可能是不同牧場配置影響牛的生長環境，從而間接地影響牛的免疫力和產奶品質。

1.3 嬰幼兒配方乳粉中磷脂的含量

除了對液態哺乳動物乳的研究，諸多學者還對市售嬰幼兒配方乳粉中磷脂的含量進行了分析。磷脂在嬰配粉中的含量為15～607 mg/100 g，各組分分別為PC：33.2～253.1 mg/100 g，PE：19.2～143.2 mg/100 g，SM：12.0～125.0 mg/100 g，PI：13.6～110.0 mg/100 g，PS：12.6～75.0 mg/100 g。不同產地、生產商、甚至生產日期都會影響嬰配粉中磷脂含量的差異，因為其中涉及了不同的配方、原料和加工工藝；即使同一品牌的嬰配粉，通常根據嬰兒年齡差異區分了不同的產品類別，因為嬰兒在每一個年齡段的營養需求不同。例如，一段（0～6月齡）嬰配粉是為了代替母乳，所以配方力求接近母乳；二段（6～12月齡）嬰配粉通常已不是嬰兒唯一的營養來源，所以配方中的營養素配比會適當調整。Liu Zhiqian等[31]對澳大利亞、加拿大和美國等地區產的32 種嬰兒配方粉中的PI進行了分析，結果表明同一月齡嬰配粉中PI含量差異不大，但不同月齡段嬰配粉中PI含量差異顯著，如一段配方粉中PI含量為37～38 mg/100 g，而二段配方粉中PI含量為115～120 mg/100 g。目前市售的嬰配粉原料多為乳清蛋白粉，也有部分使用原奶進行噴粉，所以原料中磷脂的含量存在顯著差異；在進行磷脂強化時，大部分廠家使用MFGM和大豆磷脂，也有部分使用其他牛乳磷脂濃縮物或蛋黃卵磷脂，故強化劑里磷脂的含量也存在差異[32-34]。Jiang Chenyu等[32]對4 種不同廠商的嬰配粉進行磷脂含量分析，結果顯示磷脂總量介于15.0～227.4 mg/100 g，而Fong等[33]調研的7 種嬰配粉中磷脂含量介于228～607 mg/100 g，這個較大的差異區間就是以上多種因素共同導致的。

本綜述總結了先前研究中乳及乳制品中磷脂的組分和含量，如表1所示。

表1 乳及乳制品中磷脂的組分和含量Table1 Phospholipid composition of milk and milk products

續表1

2 乳及乳制品中磷脂的功能性

磷脂是乳中一項重要的功能性營養指標，因其多項生理活性而受到廣泛關注，近年來，磷脂越來越多地被用于功能性食品添加劑和嬰兒配方乳粉中的營養強化劑[3,34]。早在20世紀初期，膳食性磷脂對心臟疾病、炎癥和癌癥患者的保健作用就引起了眾多學者的關注[5]，尤其是神經鞘磷脂，其代謝產物如神經酰胺和鞘胺醇在細胞調控方面起到了顯著的作用，被認為是最具生物活性的物質之一[56-64]。目前，磷脂在降膽固醇、提高肝功能和降低心腦血管疾病方面展現了強大的功效，其他生物活性還包括抗氧化、抗炎、抗菌和抗病毒等[16]。除了針對成年人的眾多保健功效，磷脂在建立嬰兒大腦神經系統、腸道免疫系統和胃腸消化系統等方面也起到了不可或缺的作用[41-45]。磷脂中的SM和PC被認為是磷脂中最具價值的營養物質，因為嬰兒生長必需的營養物質膽堿，有接近17%來源于這部分磷脂成分，這類營養素是維持嬰兒快速發育及合成體內生物膜必不可少的物質[13]。而磷脂中的PE可為嬰兒提供花生四烯酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等不飽和脂肪酸，這類營養素能顯著提高嬰兒的大腦和視力發育[63]。

然而，在無法提供母乳喂養的情況下，配方乳粉則成為嬰兒獲取營養物質的唯一途徑，因此，配方乳粉中的各項營養指標應最大化地與母乳相近，以達到為新生兒提供健全營養保障的目的。目前，市售的嬰兒配方乳粉通常由牛乳或羊乳制成，其磷脂含量與人乳存在顯著差異，了解母乳的營養成分是研發嬰兒配方乳粉的基礎，而了解不同種類的乳中營養物質含量的差異，能為合理選擇嬰兒配方乳粉的原料提供參考，也能為縮小配方乳粉與嬰兒營養需求的差異提供科學依據[48-49]。僅本文綜述的文獻結果顯示，母乳中磷脂總量介于13.3～40.6 mg/100 mL，嬰配粉中磷脂總量為15～607 mg/100 g。需要指出的是，嬰配粉屬于特殊配方食品，由于原料、配方和噴粉工藝的不同，其磷脂含量較母乳而言存在更為顯著的差異；且嬰配粉為濃縮乳制品，其通常需要與水進行一定比例的復溶，故嬰配粉和母乳中磷脂的含量不具備直接可比性。嬰配粉與母乳中磷脂組成的差異主要體現在PC和SM上，母乳中通常SM含量比PC高，而嬰配粉中則是PC含量比SM高，這可能是由于嬰配粉以大豆磷脂為原料進行磷脂強化，大豆磷脂富含PC而僅含少量SM[13,33]。

3 乳及乳制品中磷脂的提取和分離

乳及乳制品中包含眾多種類的糖、脂肪及蛋白質，是一類非常復雜的基質，如何高效地提取、分離及回收磷脂是該領域值得研究的課題。乳制品中磷脂的檢測前處理通常包括以下幾個步驟：提取乳中脂肪，將磷脂與乳脂中其他脂類分離并回收磷脂。

乳中總脂肪的提取方法有很多，目前運用最廣泛的是Folch法[65]。Folch法使用的提取溶劑為氯仿和甲醇按體積比2∶1配成的混合溶液，通常以20 倍體積加入待測乳制品液態試樣中，萃取液中隨后加入鹽溶液直至水相與有機相分離，乳脂即可被收集。分析化學家協會隨后也發表了總脂肪的提取方法[66]，但該法使用了氨水這類的堿性溶劑，并需要將樣品加熱至溶液蒸發，該法會導致部分磷脂水解或被氧化，所以總體效果不如Folch法。

順利提取乳脂后，便需要將磷脂與乳脂中非目標脂類分離，主要是去除乳脂中的甘油三酯和其他中性脂肪。這一步的難點在于磷脂在乳脂中含量非常低（0.5%～1%），且與乳中各類化合物存在多種相互作用力，想要盡可能多地回收磷脂通常需要借助一些外界手段，行之有效的方法包括層析柱或固相萃取（solid phase extraction，SPE）小柱[67-69]。層析柱使用起來費時費力，且需耗費大量的有機溶劑，目前已多被更快捷、環保、高效的SPE小柱取代[52-54]。典型的SPE小柱使用步驟包括：注入正己烷或氯仿溶液將SPE硅膠柱活化，在加入提取液后，使用己烷/乙醚混合液淋洗中性脂肪，再用氯仿/甲醇/水混合液洗脫并收集磷脂，最后復溶至上機溶液。Gallier等[49]對比了3 種SPE方法（Bitman法[70]、Avalli法[29]和Vaghela法[71]）對磷脂回收效率的影響，3 種方法的區別在于活化液、淋洗液和洗脫液溶劑的選擇和配比上。結果顯示Bitman法得到了最高的磷脂提取率（33.6 nmol/mg lipid），次之為Avalli法（29.6 nmol/mg lipid）和Vaghela法（20.7 nmol/mg lipid）。Avalli等[29]研究了填料分別為硅膠和C8的SPE小柱對磷脂分離效果的影響，結果顯示硅膠柱對于磷脂的分離效果更佳。在依次使用2 mL甲醇和2 mL氯仿-甲醇-水（體積比為3∶5∶8）為洗脫液的條件下，磷脂回收率能達96%，而相同條件下使用C8柱的結果僅為47.5%，作者推測C8柱的低回收率是由于磷脂部分功能基團與SPE小柱填料發生相互作用，導致其未能完全洗脫。Contarini等[5]在其綜述中對比了4 種常用于磷脂分離的固相小柱填料（硅膠、氨基、C8和C18），多數情況下硅膠小柱的分離效果明顯優于其他類型小柱，僅有Caboni等[72]研究顯示C8柱分離效果最佳。

除了上述的傳統填料，近年來學者們開發了越來越多的新型填料，如高分子復合材料、納米材料、金屬氧化物結合硅膠的復合材料和介孔材料等[52-54,59-61,73-77]。Ten-Doménech等[68]于2017年發表了一項應用于母乳中磷脂分離的新技術，將近年來的熱門的分子印跡聚合物與SPE柱結合，定向移除乳脂中非目標化合物。該技術強調特異性綁定移除，與普通SPE柱存在一定的區別，且填料經過一定處理后可重復使用。目前，該技術的檢出限比傳統SPE小柱略高，但其或將為SPE技術的發展提供一種更智能、環保、低成本且高效益的新思路。

4 乳及乳制品中磷脂的定量檢測技術

所有檢測方法的相關信息已列至表2，下文將對4 種主流方法進行詳細闡述。

表2 乳及乳制品中磷脂的主要檢測手段Table2 Popular quantification techniques for phospholipids in milk and milk products

4.1 薄層色譜法

薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）是根據展開劑中磷脂各組分與薄層板上吸附劑之間作用力不同、比移值（retardation factor，Rf）不同而達到分離磷脂組分目的的一種檢測手段[86]，TLC通常用于磷脂的定性和半定量測定，是最早應用于磷脂檢測的方法之一[13,87]。TLC的優點是操作簡單、快速、直觀、專業要求低、前期設備資金投入少，但其自動化程度低，多數情況下適用于實驗室規模的檢測，難以應用到工業界大規模樣品的批檢中。Morrison[88]、Christie[89]、Weihrauch[90]等在20世紀60—80年代開始研究TLC及2D-TLC對乳及乳制品中磷脂含量的檢測，檢測基質包括母乳、牛乳、水牛乳、羊乳、山羊乳、駱駝乳、驢乳和奶酪等，報道列出了5 類磷脂（PE、PI、PS、PC、SM）在各動物基乳中的含量，其含量和其他檢測手段得出的結果基本屬于同一范圍。Sánchez-Juanes等[85]在2009年報道使用一種更先進的HPTLC技術對生牛乳進行磷脂組分分析。近年來，隨著儀器的革新和技術的發展，TLC在國內外磷脂類化合物的檢測中已較少使用，取而代之的是更少受人為因素影響的色譜儀、質譜儀和核磁共振儀等精密儀器[86]。

4.2 高效液相色譜-蒸發光散射法

高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）法用于磷脂檢測的技術在近些年得到飛速進步，并獲得了廣泛的認可和應用。HPLC法的突出優點在于其能使非揮發性的、熱敏感的磷脂在常溫得到分離，且其封閉系統能最大限度地減少磷脂在分析過程中被氧化的程度，確保實現磷脂快速、靈敏、準確、可重復的定量分析[87]。HPLC可配置多種檢測器，包括紫外檢測器（ultraviolet，UV）、ELSD、電荷氣溶膠探測器（charged aerosol detector，CAD）和質譜儀（mass spectrometer，MS）等，其中，ELSD和MS應用最為廣泛。

ELSD的檢測原理是將揮發性高的流動相噴入帶熱氣流的檢測器中，待其蒸發后，不揮發的磷脂形成微小液滴，這些液滴散射的光進入光電倍增器后產生電流，依據不同質量的磷脂引起電流大小的差異來達到檢測的目的[2]。ELSD是一種相對新型的檢測器，它與UV、CAD和MS相比擁有諸多優點，如適用范圍寬、檢測時不存在基線漂移、對溶劑流速不敏感、能消除流動相梯度洗脫對結果帶來的不良影響等，其在乳制品等復雜基質領域有很強的應用，正在逐漸成為磷脂分析檢測的主流方法[5,34]。國際卵磷脂和磷脂協會于2003年推薦HPLCELSD法用于測量卵磷脂中的磷脂組分[51]，美國油脂化學家協會（American Oil Chemists’ Society，AOCS）也在2007年將HPLC-ELSD法收錄為分析卵磷脂的標準檢測方法[91]。

近年來，諸多學者使用ELSD法對各類乳品基質中的磷脂進行了定量分析，產品品類上涵蓋了工藝滅菌乳（巴殺乳和UHT乳）、嬰幼兒配方乳粉、成人乳粉、奶油、黃油、白脫牛奶、奶酪、乳清蛋白粉、磷脂濃縮物、MFGM等；乳的種類上涵蓋了母乳（初乳、過度乳、成熟乳）、牛乳、羊乳、驢乳等；被檢測的磷脂分量涵蓋了PE、PI、PS、PC、SM、LPE、LPC、GluCer、LacCer等[8,28-29,33,35-36,53,62-64,66,68-69,71-72,88-89]。

HPLC-ELSD法在流動相體系的選擇上主要包含兩大類：氯仿-甲醇-緩沖液/水體系和正己烷-異丙醇-緩沖液/水體系，后者極性比前者稍弱，目前GB/T 35867—2018《糧油檢驗 卵磷脂中磷脂含量的測定》中介紹了使用ELSD搭配正己烷-異丙醇-緩沖液/水體系為流動相檢測磷脂，除此之外，也有少部分文章報道了使用乙腈-甲醇-水體系的流動相。HPLC-ELSD在色譜柱的選擇上主要為正向柱，絕大部分填料為硅膠或硅膠等效材料（如二醇基鍵合硅膠），洗脫條件通常為梯度洗脫，儀器和色譜柱的選擇已統一歸納至表2。有部分文獻中的實驗對檢測方法進行了優化和驗證，如Vila等[34]開發了一項使用HPLC-ELSD對母乳和嬰幼兒配方乳粉中磷脂組分（PE、PI、PS、PC、SM）進行分析的方法，并從流動相配比和儀器運行溫度兩方面對方法進行了優化，從線性關系、重復性、檢出限和定量限4 個方面對方法進行了驗證。結果指出在使用異丙醇-正己烷-水溶液（55∶37.2∶7.8，V/V/V）作為流動相的體系中，測量溫度控制在85 ℃時，方法學驗證的各項指標達到最佳，此時回收率范圍為91.4%～107.9%，檢出限為9～76 ng，定量限為29～164 ng。

4.3 核磁共振磷譜

31P-NMR用于磷脂檢測是20世紀70—90年代發展成熟的技術，其在分析生理組織（大腦、肝臟、細胞膜等）和食品（植物油、肉類等）中磷脂含量的領域展現出了很強的應用[90-97]。31P-NMR法具有很高的靈敏度，能檢出樣品中低濃度含量的磷脂，近年來，該方法也被開發應用于乳制品等復雜基質[13,83]。31P-NMR的優勢在于不需要對樣品進行大量的化學處理，且定量分析時不需要標準品，只需在總脂肪中加入內標[63]。然而，31P-NMR儀器普及度不高，儀器運營費用昂貴，對實驗員操作的熟練程度也要求較高，所以在資金、人員、設備上投入相對較大[13,63]。31P-NMR的基本原理是檢測磷脂分子中的每個磷原子，基于各組分在不同的化學環境中會呈現出不同的31P化學位移，利用其31P核磁共振效應來確定不同組分[47]。

Andreotti等[47]使用31P-NMR對牛乳和水牛乳中的磷脂進行了定量分析，得出兩種乳中磷脂種類的分布大體一致的結論。Carcia等[22]采集了不同種類哺乳動物（牛、駱駝、馬）乳中磷脂的指紋圖譜，并與人乳比對。結果顯示，人乳和駱駝乳中富含對嬰幼兒發育起到重要作用的神經鞘磷脂（分別為7.83 mg/100 mL和11.8 mg/100 mL）和縮醛磷脂（分別為2.7 mg/100 mL和2.4 mg/100 mL）；磷脂總量在4 類乳中由高到低的排序為駱駝乳（0.503 mmol/L）＞母乳（0.324 mmol/L）＞牛乳（0.265 mmol/L）＞馬乳（0.101 mmol/L）。Murgia等[7]鑒別和定量分析了羊乳乳脂和牛乳乳脂中的磷脂組分，文中引進了單相二甲基甲酰胺/三乙基胺/鹽酸胍作為溶劑體系，相比于傳統的氯仿/甲醇/EDTA-水溶劑體系，新法能顯著提高譜圖峰的分辨率并降低化合物信號位移。MacKenzie等[51]對奶油、PC700（恒天然公司高磷脂含量的商業產品）、BPC60（恒天然公司的中性脫脂乳粉）中的PC、PE、PS、PI、SM含量進行了檢測，并與2D-TLC法做出對比，兩種方法得出的磷脂組分基本屬于同一范圍。其中，奶油中磷脂質量分數分別為0.14%（TLC法）和0.16%（31P-NMR法）；PC700分別為53.2%（TLC法）和60.6%（31P-NMR法）；BPC60分別為72.9%（2D-TLC法）和75.8%（31P-NMR法）；結果顯示2D-TLC法靈敏性更高，能檢出31P-NMR無法檢出的低含量組分，但31P-NMR更適合高效率的規模化運作，因其自動化程度更高且耗時更短。

4.4 高效液相色譜-質譜聯用

MS最大的優勢在于其具有更高的精密度、靈敏性、特異性和更強的定性能力，它不僅可以檢測磷脂總量和分量，更可以精確到對各分子種類進行定性和結構分析。目前，MS被認為是測定磷脂分量及分子種類最精確的手段，其結合三重四極桿或飛行時間MS將成為此領域新的發展方向。然而，MS儀器的購買、運行和維修費用非常昂貴，且存在同位素峰間干擾和結果再現性不穩定等問題，故而其全面推廣受到限制。即便如此，磷脂檢測技術結合MS仍具有廣闊的前景，近些年涌現出大量針對乳制品應用的報道。與液相色譜、核磁共振方法不同的是，質譜儀通常串聯離子源（ESI、EI、電感耦合等離子體（inductively coupled plasma，ICP）等）、質量分析器（四極桿、四極桿離子阱、飛行時間等）和檢測器（電子倍增器、感應電荷檢測器等）共同使用，多種儀器組件的疊加增加了其檢測方法的復雜性。

通常，質譜類檢測器使用的色譜柱多為反向柱（如C8、C18柱）或親水作用色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）柱，使用的流動相體系通常為氯仿-甲醇緩沖液或乙腈-甲醇緩沖液。值得一提的是，HILIC柱是一類既非正向柱也非反向柱的特殊色譜柱，其采用了類似正向柱的固定相，但具備反向柱的部分特征。HILIC柱是一類高效的極性物質保留柱，通過親水性作用力實現對極性物質的分離和洗脫，它能有效地改善反向色譜柱極性物質保留性差的缺點，并能有效提高電噴霧離子源的靈敏度，近些年受到了越來越廣泛的關注[30]。

除此之外，質譜類檢測器能對磷脂進行精確地定性、定量分析，同時在數據分析時結合主成分分析（principal component analysis，PCA）能對磷脂進行指紋圖譜的繪制。例如，Wang Lina等[81]使用UHPLC-Q-TOF-MS對母乳、牛乳和山羊乳中的PE、PG、PS、PI、PA、PC和SM進行分析，結果顯示人乳中有36 種PE、28 種PC、20 種PS和17 種PI，且含量顯著高于牛乳和山羊乳，同時PCA結果表明不同哺乳動物乳存在差異并可以通過PCA進行區分，因此這項技術在食品真實性溯源領域擁有廣闊的發展前景。

質譜類檢測器因擁有更高的檢測精度，部分學者探究了其高精度是否會帶來檢測結果的差異。如Tavazzi等[38]對比了HPLC-MS/MS、31P-NMR和HPLC-ELSD 3 種方法用于母乳和嬰配粉中磷脂的檢測，結果表明HPLC-MS/MS和31P-NMR得到的結果無顯著差異（P＞0.05），而HPLC-MS/MS和HPLC-ELSD僅在得到的PE含量結果上出現細微差異，故3 種方法測得的數據較為穩定，互相之間具有一定的參考性。

5 結 語

近年來，隨著人們的生活水平日漸提高，高品質、高營養價值、含功能性添加成分的乳制品越來越多地受到人們追捧，磷脂作為乳中重要的功能性營養素，其檢測方法也成為了國內外相關領域的研究熱點。我國在此方面起步較晚，雖然已有較大進步，但是對于上述各類檢測手段的研究還不夠深入。本文綜述了近20 年來國內外針對乳品中磷脂成分的主流檢測方法，其中，TLC或將逐步被其他精密儀器所取代，MS是目前最精細的磷脂檢測手段，但HPLC-ELSD應用最為廣泛，如果實驗室條件允許，31P-NMR也可成為一種快速且結果精確的備選檢測方法。上述儀器都有其各自的優缺點，檢測人員需對待測樣品的特征、設備的可用性和人員的實驗技能進行綜合評估，因地制宜地選取最佳檢測方案。

就磷脂提取而言，如何有效地去除雜質、提高萃取效率、確保檢測結果的穩定性和重復性仍是目前存在的技術難點。SPE柱的應用能有效且定向地對檢測基質進行除雜，因其填料的多樣性和創新性，SPE小柱在未來的應用或將逐步增加，但檢測人員仍需考慮SPE柱在使用時回收率較低的缺點。

就定量方法而言，其未來發展趨勢應根據需求進行劃分：如針對企業進行相關產品檢測，液相色譜-ELSD足以滿足批檢和抽檢的需求；但從科研角度考慮，質譜類儀器無疑擁有更大的優勢，這一點從近5 年磷脂檢測技術的發文趨勢上可以看出。質譜類儀器因其精密性和高通量，現有技術已能對磷脂上百種分子種類進行定量分析，未來還能對更多未知的種類進行篩查及鑒別。此外，結合PCA，科研人員能對磷脂進行指紋圖譜的繪制，這項技術在食品的真實性和溯源性鑒定上擁有巨大潛力。從表1匯總的數據來看，各文獻報道的磷脂含量差異性較大，實驗數據間難以互相作對比，檢測人員在參考數據時需對照所使用的檢測方法和儀器條件。一點重要的啟示是，新方法在開發時需經過縝密的方法學驗證，需從精密度、檢出限、定量限、回收率和線性關系等幾個維度對方法進行綜合評估，以得到最接近真實值、有對比意義且重復性好的結果。