轉錄組測序技術在植物乳桿菌細菌素合成 研究中的應用研究進展

趙 樂，孟祥晨

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

細菌素是由核糖體合成并分泌至胞外介質的具備生物活性的蛋白質、多肽或前體多肽，當這些物質達到一定數量時可抑制親緣關系相近的致病菌或腐敗菌的生長[1]。 但細菌素的抑菌機理復雜多樣，且抑菌效果易受眾多因素控制，導致其在食品防腐領域的實用范圍較為局限。細菌素抑制目標菌的機制主要有2 種：通過與目標菌細胞壁及被膜接觸后形成膜孔道，導致菌體內容物外泄而死亡，Munch等[2]等驗證了LantibioticNAI-107菌株可與細胞壁骨架的組成成分萜醇結合，進而破壞細胞膜的正常生理功能；另一類抑制機制體現在分子水平，通過抑制相關代謝基因的表達或蛋白分泌，從而破壞目標菌的正常生長代謝，如分離于開菲爾的細菌素F1可在胞內與DNA結合，阻礙其轉錄、翻譯過程[3]。由于乳酸菌細菌素種類頗多，因此，根據生物化學特性、分子質量、熱穩定性及抑菌效果將細菌素進行分類，既有利于深入研究各類細菌素的具體抑菌機制，又可通過分離純化、質譜等方法確定細菌素所包含的二硫鍵及單硫鍵，便于改造細菌素特性，進而實現多領域的開發應用。此外，有研究表明，可通過對已知菌株的細菌素基因設計引物，根據克隆得到的相關基因對細菌素進行分類鑒別[4]。隨著乳酸菌新菌種的不斷發現，使得分離純化的新型細菌素無法再次歸類到最初由Klaenhammer[5]提出的細菌素類別中，因此在原來的基礎上進一步更新細菌素的分類方法迫在眉睫。不同研究者對細菌素的分類標準不同，本文總結主要的細菌素分類，突出它們的理化特性，并描述某些細菌素在膜水平上起作用的機理。根據各類細菌素的生物遺傳特性、乳酸菌的菌屬、熱穩定性、是否存在二硫鍵、分子質量、水解酶的敏感性及抑菌譜，可分為以下四大類（表1）：1）ClassⅠ細菌素，主要包括羊毛硫細菌素及其衍生物，此類細菌素在合成前體肽時往往會經酶識別并修飾，通過作用于細胞壁骨架或使細胞膜形成孔洞，進而控制腐敗微生物及致病菌，其又可分為6 個亞類，如分離自植物乳桿菌LL441的Plantaricin C、Nisin和Pep5等[6]；2）ClassⅡ細菌素，是一類不包含羊毛硫氨酸的小分子肽，肽鏈之間僅以二硫鍵連接，未經酶修飾，此類細菌素又可分為4 個亞類，其中Ⅱa型細菌素多肽鏈的N末端序列絕大多數為“Y-G-N-G-V-N”，可顯著抑制李斯特菌，如Pediocin PA-1和Sakacin P，Ⅱb型細菌素在2 種短氨基酸序列的共同作用下抑菌活性達到最大，如Lactococcin G、Plantaricins等[7]；3）ClassⅢ細菌素，如熱不穩定的溶菌素Enterolysin A和非溶解性細菌素Helveticin J，它們在酶催化下可裂解構成細胞壁的內酶肽；4）ClassⅣ細菌素，如對酶敏感的Plantaricin S和Leuconocin S，其抑菌活性需憑借蛋白等生物大分子協同作用才能發揮抑菌活性[8]。

表1 乳酸菌細菌素的分類Table1 Classification of lactic acid bacterial bacteriocins

1 植物乳桿菌細菌素的應用

1988年美國食品藥品監督管理局通過急慢性動物體實驗操作及體內交叉耐受性實驗表明，當人類每日攝入的Nisin含量低于2.9 mg/d時對人體無害[9]，因此將Nisin列為公認安全級別，1990年又將其納入GB 2760—86《食品添加劑使用衛生標準》。隨著新型乳酸菌細菌素的表征及基因工程技術的完善，天然抑菌物質細菌素憑借其安全性已被廣泛應用于保健食品、醫療藥物、飼料添加劑、畜牧養殖等領域。廣譜細菌素應用范圍更廣泛，而窄譜細菌素能夠更具體地針對性抑制食物中的某些高風險細菌，如單核細胞增生李斯特菌，且不會影響無害微生物[10]。細菌素還可以濃縮制劑形式作為食品防腐劑或保質期延長劑，應用于食品的輔助生產[11]。此外，細菌素還可用于開發具備抑菌活性的食品包裝紙或塑料薄膜。近年來，細菌素與高壓處理或脈沖電場等物理方法的結合也為食品的有效保存提供了良好機會[12]。但細菌素的有效性通常取決于環境因素，如pH值、溫度、食物結構組分及食物微生物群等。

1.1 在食品工業與保鮮防腐中的應用

乳酸菌細菌素在乳制品、肉制品、果蔬制品、酒品加工及食品包裝紙的生產中展現出很大潛力。隨著酸乳產業的蓬勃發展，研究者逐漸發現與鮮乳生產線相比，酸乳生產線受雜菌污染程度明顯降低，隨后多項研究證明，發酵過程中次級代謝產物類細菌素物質占據主導作用[13]。Arokiyamary等[14]從干酪中分離得到一株乳酸桿菌，其所產細菌素可抑制金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、傷寒桿菌等多種致病菌。Bizani等[15]發現，4 ℃時蠟樣菌素8A可導致牛乳及干酪中的單核細胞增生李斯特菌生長對數期滯后。Ghalfi等[16]發現，豬肉在冷藏過程中乳酸彎曲桿菌素和精油對腐敗菌的抑制起協同作用，二者均可顯著抑制單核細胞增生李斯特菌生長。劉國榮等[17]比較320 AU/g細菌素與超高壓處理對切片火腿的保鮮效果，對火腿的色澤、質構、理化性質等因素進行評估，發現二者聯合作用防腐保鮮效果最佳，可延長切片火腿貨架期。Martínez-Viedma等[18]發現，在蘋果酒中添加伏爾加霉素AS-48可控制片球菌的產酸量，進一步研究發現，此類細菌素主要通過鈍化目標菌的細胞膜活性進而發揮抑菌活性。除上述功能特性，細菌素還可與某些高分子物質結合，形成具備抑菌活性的食品包材。 Jin等[19]通過掃描電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡發現，Nisin顆粒均勻分布在聚乳酸基體表面，Nisin可顯著抑制培養基和液體蛋清中單核細胞增生李斯特菌的生長。綜上，細菌素在食品領域作為生物防腐抑菌劑具有廣闊的應用前景。

1.2 在生物醫藥領域中的應用

幽門螺桿菌侵染是導致胃腸道潰瘍的主要因素，其可吸附于消化道黏膜及相應受體蛋白并釋放毒性因子，引發非特異性炎癥。細菌素可形成屏障保護層，占據細胞外膜吸附位點，進而阻礙致病菌侵入；還可刺激機體產生特異性與非特異性免疫物質，選擇性抵御臨床疾病中的靶向致病菌生長；又可作為潛在抗癌劑，針對目標癌細胞釋放毒力[20]；此外，其還對醫療手術后期易感染型細菌具有很強的破壞力，且通常不會產生耐藥性。也有研究發現，乳酸菌素在調節腸道微生態、增強機體免疫力、預防幽門螺桿菌侵染等方面效果明顯。臨床上，細菌素可緩解因消化道不適引起的腹脹、腹瀉等疾病，還可添加到口腔漱口液中起預防齲齒作用，醫療領域多采用基因工程技術挖掘及修飾細菌素編碼基因，從而提高細菌素產量。

1.3 在畜牧養殖及飼料研發中的應用

由于抗生素及激素的不合理使用或濫用，選擇乳酸菌細菌素替代傳統使用的抗生素更具吸引力。動物飼料中細菌素的添加既能提高動物免疫力，還能提高精子存活率，但目前我國細菌素在動物飼料中的應用僅限于理論研究，安全性還有待考察[21]。有研究者發現，在肉雞養殖中，投喂按合適比例混合的抗生素和細菌素可取得良好效果。Mccormick等[22]研究發現，將乳酸菌素Lacticin3147涂抹到奶牛乳頭可減少革蘭氏陽性菌的滋生，在一定程度上可緩解乳房炎等癥狀。Bhunia等[23]在研究小鼠和兔子的免疫功能時發現，細菌素Pediocin AcH對動物機體無任何不良反應。Mota-Meira等[24]發現，將細菌素分離純化后并濃縮，通過靜脈注射可有效避免動物患感染性疾病。因此研究細菌素與消化道優勢菌群的關系具有重要意義。

1.4 在調節腸道菌群結構中的應用

在研究細菌素調節腸道菌群的具體機制時既要明確其對目標致病菌的抑制效果，也要關注其對腸道菌群結構的影響[25]。Lü Xinran等[26]通過掃描電子顯微鏡發現，從鯽魚腸道分離出的植物乳桿菌FGC-12所產的細菌素可使目標副溶血性弧菌胞內電導率增大，破壞胞內物質平衡。Dabour等[27]對小鼠進行體外實驗時發現，片球菌素Pediocin PA-1在不影響小鼠腸道菌群結構的基礎上可有效抑制單核細胞增生李斯特菌感染。由此推測，乳酸菌細菌素可靶向拮抗機體內致病菌，且不破壞宿主腸道菌群平衡。Piewngam等[28]驗證了細菌素可以通過阻斷金黃色葡萄球菌的agr群體感應信號傳導系統，進而干擾其在腸道的定植能力。以上報道為研究乳酸菌細菌素是否通過切斷靶向菌的信號傳導進而介導腸道微生態提供了新思路。

2 生物信息學技術在乳酸菌代謝研究中的應用

生物信息學是以計算機科學和應用數學為基礎理論，將生命科學領域測得的生物信息經搜索比對，分析相關的核酸信息和蛋白結構基因，從而定位功能基因的一門科學[29]。生物信息學在處理、整合和分析海量“組學”數據方面起著關鍵作用，利用數據庫分析出重要的調控基因或蛋白，然后進行有針對性的實驗驗證，探索代謝和調控網絡。目前建立了一類細菌素基因組挖掘工具，一種基于細菌素數據庫和Motif數據庫的網絡服務器BAGEL，它可以識別DNA序列中假定的細菌素開放閱讀框（open reading frame，ORF）[30]。此外，該服務器還考慮了基因組背景，即對于每種潛在的細菌素編碼ORF，都會分析基因組中周圍區域的序列，尋找編碼參與生物合成、運輸、調節或免疫相關蛋白的基因。生物信息學在食品領域的主要應用包括：功能性菌株的全基因組測序，原核轉錄組、比較轉錄組和翻譯組等RNA水平上的高通量測序，靶向代謝組學測序，無標記或iTRAQ等定量蛋白組學分析。Hansen[31]基于生物信息學技術發現，在嘌呤缺失條件下，乳酸乳球菌MG1363中27 個基因的表達發生顯著變化。Guillot等[32]對乳酸乳球菌1403的細胞質蛋白進行二維凝膠電泳分析，通過肽質量指紋圖譜鑒定了230多個氨基酸位點，這項研究使得在蛋白質組水平上描述與重要生理過程和工藝特性相關的細胞通路（糖酵解、發酵、核苷酸代謝、蛋白質水解、脂肪酸和肽聚糖合成）成為可能。截止目前，被普遍使用的數據庫主要為美國國家生物技術信息中心（NCBI）的GenBank數據庫[33]。除此以外，歐洲生物信息學研究所的EMBL核酸序列數據庫和日本信息生物學中心的DDBJ數據庫也被大家熟知。應激性環境在乳酸菌的貯存及使用過程中經常存在，通過比較基因組學方法可以預測與脅迫相關的轉錄調控因子，初步猜測其結合位點和調控 基因[34]。此外，采用轉錄組和蛋白質組等多組學聯合對差異表達基因進行功能注釋已成為未來分析趨勢。

3 轉錄組測序技術在細菌素合成研究中的應用

3.1 轉錄組測序技術

1995年，Velculescu等[35]提出轉錄組的概念，即從整體轉錄水平分析不同細胞或組織在特定條件下所轉錄的所有RNA，從而揭示生物學通路和調控分子機制 （圖1）。該技術能檢測到編碼蛋白的RNA及非編碼RNA，如rRNA、tRNA、sRNA、snoRNA等[36]。轉錄組學通常包含2 種研究技術：1）基于雜交的微陣列基因芯片技術；2）基于測序的轉錄組測序技術。前者利用樣品與探針的雜交信號獲取序列信息，但樣品制備較復雜且特異性低，因此在應用上受限[37]。后者是目前應用分析的主要手段，又可分為第1代測序技術、第2代測序技術和第3代測序技術。其中第2代測序技術（RNA-Seq）將提取的樣品mRNA經富集過濾、除去rRNA及隨機的片段化處理最終反轉為cDNA，構建文庫再使用高通量測序儀上機測序。將測序結束后得到的海量數據與參考基因組比對，即可從基因表達水平定量分析轉錄本的遺傳信息。通過差異表達倍數篩選出差異基因，對其進行GO（Gene Ontology）功能注釋和KEGG通路富集分析，進而推測其功能特性[38]。第3代測序技術采用單分子實時測序，無需聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR） 擴增，且所需樣品少。美國PacBio公司的SMRT-Seq技術在第3代測序中最具代表性，但由于技術受限且測序價格昂貴，因此還有待完善[39]。

圖1 轉錄組測序和分析流程示意圖Fig. 1 Flow chart of transcriptomic sequencing and analysis

3.2 轉錄組學在乳酸菌生長及代謝調控研究中的應用

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）作為抗菌劑、藥物和塑料的合成前體，被廣泛添加于各種發酵食品。PLA是乳酸菌胞體中苯丙氨酸分解代謝的產物，其生物合成與乳酸脫氫酶密切相關。2019年，Sun Daqing等[40]為探究代謝產物與發酵特性之間的聯系，對可產生PLA的植物乳桿菌LY-78進行全基因組及轉錄組測序，基因組和轉錄組的分析結果揭示了該菌株PLA生物合成的可能途徑、操縱子和關鍵基因。總體而言，這項研究證明PLA可以作為乳酸菌苯丙氨酸合成代謝的副產物，同時為闡明PLA生物合成機理提供了新的依據，并為未來PLA的生物合成及應用提供了新的候選基因和研究策略。Chun等[41]通過泛基因組、轉錄組和代謝物分析，研究嗜鹽四聯球菌的基因組和代謝多樣性。嗜鹽四聯球菌DSM 20339的轉錄組結果表明，高鹽條件下菌株可通過異乳酸途徑產生更多的乙酸鹽。盡管從嗜鹽四聯球菌基因組中鑒定出與甜菜堿、脯氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、膽堿和瓜氨酸代謝相關的基因，但轉錄組和代謝物分析表明，甜菜堿是高鹽含量下主要的相容性溶質，同時推測瓜氨酸在滲透脅迫中也起重要作用。干酪中牛乳蛋白的分解代謝是影響最終產品感官特性的一條重要途徑，Pangallo等[42]采用轉錄組學研究乳酸菌蛋白水解相關基因在干酪成熟過程中的轉錄活性，研究發現，編碼細胞被膜蛋白酶的基因prtP、編碼二肽基氨基肽酶的基因pepX、編碼氨肽酶的基因pepN和編碼支鏈轉移酶的基因bcaT均有利于牛乳蛋白產生揮發性芳香化合物。

3.3 轉錄組學在乳酸菌環境脅迫應激研究中的應用

Hagi等[43]利用RNA-Seq測序技術對腸球菌有氧應激反應基因進行分析，研究發現，丙酮酸脫氫酶復合物合成相關基因表達明顯上調，轉錄調節因子spx和編碼UvrABC系統蛋白的基因表達也上調。Wang Xiuwen等[44]對產乳酸菌株凝結芽孢桿菌P38進行比較轉錄組分析，以研究其在2-糠醛脅迫下和不脅迫時培養的表達特征。結果表明：在2-糠醛脅迫下，凝結芽孢桿菌P38的生長速率降低，其中740 個基因表達上調，540 個基因表達下調；KEGG通路富集分析顯示，2-糠醛脅迫對9 條通路有極顯著影響（P＜0.01），其中糖酵解/糖異生途徑中關鍵基因的下調及三羧酸循環中相關基因的上調表明， 2-糠醛脅迫對乳酸發酵有負向影響；此外，2-糠醛脅迫下7 個醇脫氫酶基因和8 個短鏈脫氫酶/還原酶基因的表達被誘導，推測這些基因參與調節糠醛耐受性。Diez等[45]對乳酸乳球菌的轉錄組結果進行分析，認為在乙醇脅迫下，精氨酸脫亞胺酶途徑被激活，并闡述了乳酸乳球菌NZ9700對乙醇的分子耐受機制；通過DNA微陣列全局轉錄組分析發現，該菌株對培養基中2%的乙醇具有適應性，且67 個基因的表達發生顯著變化，其中精氨酸脫氨酶途徑中參與精氨酸降解的基因顯著上調，達20～40 倍。趙山山[46]對鹽耐受時植物乳桿菌ST-III的RNASeq結果進行分析，發現參與氨基酸轉運、胞內離子平衡、碳水化合物代謝和DNA損傷修復等基因的轉錄水平發生顯著變化，推測上述基因對抵御鹽脅迫起重要作用。 Arnold等[47]通過轉錄組測序技術發現，模擬胃腸道應激下不同菌株的基因表達譜有所差異，其中鼠李糖乳桿菌AMC143暴露于堿性環境時生長受到抑制，熒光定量PCR結果顯示，編碼膽鹽水解酶的基因bsh表達量有所下降。綜上所述，將微生物學與轉錄組學結合可進一步闡明細菌對外界脅迫的應激機制。

4 結 語

由于調控細菌素合成基因的多樣性及其調控機制的復雜性，目前關于植物乳桿菌細菌素合成機制的研究相對缺乏，利用轉錄組和蛋白質組等多組學技術挖掘植物乳桿菌中重要功能基因，從轉錄水平、蛋白水平和代謝水平多層面研究細菌素合成系統的表達差異是未來的研究方向。利用轉錄組學等生物信息分析手段，進而提高植物乳桿菌細菌素產量的方法必將成為食品領域的研究熱點，進而更好發揮生物保護發酵劑的生物防腐作用。