七氟醚調控miR-34a/HMGB1表達抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和侵襲

李修志 李加鵬

目前，外科手術仍是腫瘤治療的重要手段，但術后出現的復發和轉移是影響治療的重要因素。因此，如何在圍術期抑制腫瘤細胞的惡性增殖和轉移一直是學者們研究的重要課題。麻醉藥是手術過程中不可或缺的存在，其對腫瘤細胞的影響逐漸引起人們的關注。七氟醚是一種廣泛應用于實體瘤切除手術麻醉誘導和維持的吸入麻醉劑，在腫瘤圍手術期發揮著重要作用。大量研究顯示，七氟醚對乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌和肺癌等惡性腫瘤細胞增殖和侵襲等具有一定的抑制作用[1-4]。微小RNAs(miRNAs)是一類與腫瘤發生發展關系密切的小分子RNA，在腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等生物學過程中發揮著重要作用。已有研究證實，七氟醚可通過調控miRNAs的表達影響結直腸癌和膠質瘤等腫瘤細胞的生物學過程[5,6]。miR-34a在乳腺癌組織和細胞中異常低表達，其過表達可抑制癌細胞增殖和侵襲[7]；七氟醚被證實可通過上調miR-34a的表達抑制胃癌和結腸癌的發生發展[8,9]，但其是否通過調控miR-34a表達影響乳腺癌細胞的惡性進展尚不清楚。本研究以乳腺癌MDA-MB-231細胞為研究對象，通過觀察七氟醚對MDA-MB-231細胞中miR-34a表達的影響，探討miR-34a是否以及如何參與七氟醚抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人乳腺癌MDA-MB-231細胞株(中國科學院上海細胞所細胞庫)，miR-34a模擬物、miR-34a抑制劑及其相應的陰性對照miR-NC和anti-miR-NC(廣州瑞博生物)，青鏈霉素、胰酶消化液、胎牛血清、DMEM培養基(美國GIBCO公司)，二甲基亞楓和MTT試劑(美國Sigma公司)，HMGB1單克隆抗體和β-actin 單克隆抗體(美國Santa Cruz 公司)，Matrigel (美國BD公司)，PVDF 膜(美國Millipore公司)，引物(上海英駿生物)，發光底物 ECL、BCA蛋白檢測試劑盒、逆轉錄試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(碧云天生物公司)，Transwell 小室(美國Corning公司)，七氟醚揮發罐(美國Abott公司)。

1.2 細胞培養及七氟醚處理 采用含有10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素的DMEM培養基于37℃、5%CO2的細胞培養箱中常規培養MDA-MB-231細胞。將對數生長期的MDA-MB-231細胞以適當密度種植于96孔細胞板上，培養箱內常規培養過夜。將其分為對照組、1.7%七氟醚組、3.4%七氟醚組和5.1%七氟醚組，并置于兩側壁分別裝有進氣口和出氣口的無菌密閉的玻璃箱中，并采用麻醉機和麻醉氣體監測儀連接進氣口和出氣口。其中對照組按照6 L/min通入5%CO2和95%O2的混合氣體處理4 h，而其余3組分別以1.7%、3.4%和5.1%七氟醚6 L/min處理4 h。各組細胞處理結束后，放入細胞培養箱內常規培養48 h。分別采用MTT法檢測細胞的增殖率，克隆形成實驗檢測細胞的克隆形成能力，Transwell小室檢測細胞的侵襲能力，RT-PCR檢測細胞中miR-34a和HMGB1 mRNA的表達，Western blot檢測HMGB1蛋白的表達。

1.3 細胞增殖實驗 將長勢良好的對數生長期MDA-MB-231細胞以每孔1×104個密度種植于96孔細胞板上，培養箱中常規培養24 h。將其按照1.2中的分組和七氟醚處理結束后，于培養箱內繼續培養48 h。加入5 g/L的MTT溶液反應4 h，再加入150 μl二甲基亞楓溶解藍紫色結晶。使用酶標儀在570 nm波長處檢測各組細胞的吸光度值。按照公式：細胞增殖率(%)=(實驗孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(對照孔吸光度值-空白孔吸光度值)×100%計算各組細胞的增殖率。實驗重復3次。

1.4 細胞克隆形成實驗 將對數生長期的MDA-MB-231細胞按照每孔300個細胞接種于6孔細胞板上，使細胞分布均勻后，置于培養箱內培養6 h。再按照1.2中的分組與處理進行七氟醚刺激。待七氟醚刺激結束后，移入培養箱內常規培養14 d。取出培養板，吸取培養液后，采用磷酸緩沖液洗滌細胞后，分別加入1 ml 的甲醇固定和200 μl的姬姆薩染色20 min后，以自來水洗去染液后，晾干。置于顯微鏡下觀察克隆數(>50個細胞)，并以克隆數與接種細胞數的百分比表示各組細胞的克隆形成率。

1.5 細胞侵襲實驗 將對數生長期的MDA-MB-231細胞以每孔1×104個密度接種至24孔細胞板上，于細胞培養箱內常規培養過夜。根據1.2中的分組及處理給予不同濃度的七氟醚處理后，轉入細胞培養箱中常規培養24 h。胰蛋白酶消化收集各組細胞后，取細胞懸液(濃度為1×104個/ml)200 μl加入到 Matrigel基質膠包被的Transwell小室上室中，而下室內加入含10%胎牛血清的培養基500 μl。常規培養24 h后，分別以甲醛固定和結晶紫染色15 min。使用棉簽小心除去上室內殘留的細胞后，顯微鏡下隨機選取6個視野觀察穿過微孔濾膜的細胞數。實驗重復3次。

1.6 miR-34a和HMGB1mRNA表達的檢測 收集對照組、1.7%七氟醚組、3.4%七氟醚組和5.1%七氟醚組細胞，以Trizol法提取細胞總RNA后，根據逆轉錄試劑盒說明書步驟將RNA逆轉錄為cDNA。再以1.5 μl cDNA為模板，加入12.5 μl Master Mix、各2 μl的上下游引物和7 μl的ddH2O配成25 μl的PCR反應體系。按照95℃ 7 min，1個循環；95℃ 30 s，58℃ 30 s ，72℃ 4 min，共40個循環的反應條件上PCR儀進行擴增，以U6和β-actin為內參，2-ΔΔCt法計算各組細胞中miR-34a和HMGB1mRNA的表達水平。

1.7 HMGB1蛋白表達的檢測 向收集到的5.1%七氟醚組、3.4%七氟醚組、1.7%七氟醚組和對照組細胞中加入細胞裂解液于冰上裂解提取總蛋白后，參照BCA蛋白檢測試劑盒步驟流程檢測總蛋白的濃度。按照1∶4比例加入5×上樣緩沖液，放入沸水中變性5 min。使用微量加樣器向SDS-PAGE凝膠中加入蛋白樣品10 μl進行電泳分離。以轉膜儀轉膜后，置于含5%脫脂奶粉的TBST工作液中封閉1.5 h。封閉結束后，將膜轉入一抗工作液中4℃下孵育過夜。以TBST工作液漂洗3次后，將膜放入二抗工作液中常溫孵育1 h。以ECL暗室內顯影后，Image J圖象分析軟件分析HMGB1蛋白條帶的灰度值，并以內參β-actin進行校正。

1.8 實驗分組與細胞轉染 實驗分為對照組(未處理)、七氟醚組(給予5.1%七氟醚刺激)、七氟醚+anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC后給予5.1%七氟醚刺激)和七氟醚+anti-miR-34a組(轉染miR-34a抑制劑后給予5.1%七氟醚刺激)。將對數生長期的MDA-MB-231細胞以每孔1×105個密度接種至6孔細胞板上，置于培養箱中常規培養。待細胞融合度達70%時，按照脂質體2000說明書步驟將miR-34a抑制劑及其相應對照anti-miR-NC轉染至七氟醚+anti-miR-34a組和七氟醚+anti-miR-NC組細胞中。轉染24 h后，給予5.1%七氟醚刺激4 h。按照實驗分組處理結束后，分別進行增殖實驗、克隆形成實驗、侵襲實驗以評價miR-34a對七氟醚刺激下MDA-MB-231細胞增殖和侵襲的影響。

1.9 熒光素酶實驗 TargetScanHuman軟件預測發現HMGB1 3’-UTR區域有能夠與miR-34a互補的核苷酸序列，猜測HMGB1可能是miR-34a的靶基因。為了驗證兩者的靶向關系，通過構建含HMGB1 3’-UTR序列的野生型(HMGB1-WT)和突變型(HMGB1-MUT)的熒光素酶報告載體質粒，并參照脂質體2000說明書步驟行miR-NC(miR-34a模擬物陰性對照)+HMGB1-WT、miR-34a(miR-34a模擬物)+HMGB1-WT、miR-NC+HMGB1-MUT、miR-34a+HMGB1-MUT 4組共轉染。轉染48 h后，檢測各組細胞的熒光素酶活性，具體的檢測流程參照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書。實驗檢測3次。

1.10 統計學分析 應用SPSS 22.0統計軟件，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 七氟醚抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和侵襲 1.7%、3.4%和5.1%濃度的七氟醚作用后MDA-MB-231細胞增殖率和克隆形成率以及侵襲細胞數均呈濃度依賴性降低，與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組細胞增殖率、克隆形成率和侵襲細胞數比較

2.2 HMGB1是miR-34a的靶基因 HMGB1 3’ UTR存在能夠與miR-34a互補結合的核苷酸序列。與HMGB1-WT共轉染的miR-34a組細胞的熒光素酶活性較miR-NC組顯著降低(P<0.05)，而與HMGB1-MUT共轉染的miR-34a組和miR-NC組細胞的熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、3。

表2 HMGB1 3’ UTR與miR-34a的結合位點

表3 4組細胞熒光素酶活性的比較

2.3 七氟醚促進乳腺癌MDA-MB-231細胞中miR-34a表達而抑制HMGB1表達 與對照組比較，不同濃度的七氟醚刺激后MDA-MB-231細胞中miR-34a表達水平顯著升高，而HMGB1 mRNA和蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，且具有濃度依賴性。見圖1，表4。

2.4 miR-34a低表達逆轉七氟醚對乳腺癌MDA-MB-231細胞中HMGB1表達的抑制作用 與對照組比較，七氟醚刺激后MDA-MB-231細胞中miR-34a表達水平顯著升高，而HMGB1mRNA和蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)；與七氟醚組比較，七氟醚+anti-miR-34a組細胞中miR-34a表達水平顯著降低，而HMGB1mRNA和蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)；然而，miR-34a和HMGB1在七氟醚+anti-miR-NC組和七氟醚組細胞中的表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表5。

圖1 Western blot檢測HMGB1蛋白的表達

表4 4組細胞中miR-34a、HMGB1 mRNA和HMGB1蛋白表達比較

圖2 Western blot檢測HMGB1蛋白表達

2.5 miR-34a低表達逆轉七氟醚對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和侵襲的抑制作用 與對照組比較，七

表5 4組細胞中miR-34a、HMGB1 mRNA和HMGB1蛋白表達比較

氟醚刺激后MDA-MB-231細胞的增殖率、克隆形成率和侵襲細胞數均顯著降低(P<0.05)；與七氟醚組比較，細胞增殖率、克隆形成率和侵襲細胞數在七氟醚+anti-miR-NC組中無顯著改變(P>0.05)，但在七氟醚+anti-miR-34a組中均顯著升高(P<0.05)。見表6。

表6 4組細胞增殖率、克隆形成率和侵襲細胞數比較

3 討論

乳腺癌是女性中發病率很高的惡性腫瘤，嚴重威脅女性的身體健康和生命安全。隨著科學界對麻醉藥研究的深入，臨床常用的麻醉藥——七氟醚對乳腺癌的影響逐漸受到關注。Xu等[10]研究指出，七氟醚可通過下調MMP-9抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲和遷移。Yao等[11]研究發現，七氟醚可通過抑制NF-κB活性下調轉移相關蛋白MMP-2和MMP-9的表達抑制乳腺癌AU565細胞的增殖和轉移。另外，Liu等[12]研究指出，七氟醚可通過上調miR-203表達抑制乳腺癌細胞增殖。可見，七氟醚對乳腺癌細胞的惡性增殖和侵襲具有一定的抑制作用，但其具有的影響機制尚不完全明確。

Li等[8]在胃癌的研究中發現，七氟醚減弱胃癌MGC-803細胞的黏附能力與上調miR-34a的表達有關。Shan等[9]在結直腸癌的研究中指出，miR-34a表達上調是七氟醚抑制HCT116細胞增殖、侵襲和遷移的重要機制。眾所周知，miRNAs在乳腺癌細胞的增殖和轉移過程中扮演著重要角色，其成員miR-34a被證實在乳腺癌細胞中低表達，而上調其表達可抑制乳腺癌胞MCF-7、MDA-MB-231細胞的增殖和侵襲[13]。因此，猜測七氟醚是否是通過上調miR-34a表達影響乳腺癌細胞的惡性進展。為了驗證是猜想，本研究以1.7%、3.4%和5.1%七氟醚處理乳腺癌MDA-MB-231細胞4 h后發現，七氟醚除了可呈濃度依賴性抑制MDA-MB-231細胞增殖和侵襲外，還可引起miR-34a表達的升高。同時，通過轉染miR-34a抑制劑成功下調miR-34a表達后發現，七氟醚對MDA-MB-231細胞增殖和侵襲的抑制作用得到部分逆轉。這提示miR-34a在七氟醚抑制MDA-MB-231細胞增殖和侵襲過程中發揮積極作用。

HMGB1是一種高度保守的核內非組蛋白染色體結合蛋白，在宮頸癌、胃癌和肺癌等多種腫瘤組織和細胞中異常高表達，與腫瘤浸潤和轉移關系密切，可通過促進細胞的增殖和侵襲等在腫瘤的發生發展過程中發揮著重要促進作用[14-16]。HMGB1在乳腺癌組織中異常高表達，與腫瘤細胞分化、腫瘤TNM分期和淋巴結轉移等有關；上調其表達可增強腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，而下調其表達可降低細胞的增殖與侵襲[17,18]。Chandrasekaran等[19]證實，miR-34a可通過靶向下調HMGB1抑制宮頸癌和結直腸癌細胞細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究進一步采用生物信息學軟件預測miR-34a的靶基因，最終將HMGB1作為研究對象。HMGB1 3’ UTR區域存在與miR-34a結合的核苷酸序列，并且熒光素酶實驗證實，miR-34a可與HMGB1 3’ UTR位點結合降低轉染含HMGB1 3’-UTR序列的野生型(HMGB1-WT)質粒的熒光素酶活性；同時下調miR-34a表達可引起HMGB1表達升高。這表明HMGB1是miR-34a的靶基因。Wang等[20,21]分別在肺癌和肝癌的研究中證實七氟醚可抑制HMGB1的表達。本研究以1.7%、3.4%和5.1%七氟醚處理后發現，乳腺癌MDA-MB-231細胞中HMGB1表達水平逐漸降低。結合前面研究表明，下調miR-34a可通過靶向上調HMGB1表達促進MDA-MB-231細胞增殖和侵襲，進而逆轉七氟醚對MDA-MB-231細胞增殖和侵襲的抑制作用。結果提示，七氟醚可通過上調miR-34a表達引起HMGB1表達下降進而減弱MDA-MB-231細胞增殖和侵襲。

綜上所述，七氟醚可通過調控miR-34a/HMGB1表達抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和侵襲。該結果進一步豐富了七氟醚抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲的分子機制，也為臨床圍術期使用七氟醚防治乳腺癌的惡性進展提供了新線索。