TIM-3、STAT3、IL-6在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)及臨床意義

李福青 王紅 蔣海濤 杜勝奇 鐘江利

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

結(jié)直腸癌發(fā)病率及患病率呈逐年上升趨勢(shì)，且患者的發(fā)病率呈年輕化，給人類的生命健康帶來了極大的威脅，屬于危害生命健康的重大疾病。在我國(guó)，除肺癌和胃癌之外，結(jié)直腸癌的患病率居第3位，伴隨飲食結(jié)構(gòu)、生活方式的不同，農(nóng)村及城市中結(jié)直腸癌發(fā)病率也不一致，在城市惡性腫瘤中，結(jié)直腸癌發(fā)病率僅次于肺癌居第二位，在農(nóng)村地區(qū)結(jié)直腸癌發(fā)病率低于胃癌、肺癌、食管癌、肝癌居第五位〔1，2〕。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)每年新增加約120萬例結(jié)直腸癌患者，同時(shí)死亡人數(shù)每年高達(dá)60.9萬〔3〕，因此，探索結(jié)直腸腺癌的發(fā)生發(fā)展刻不容緩。白細(xì)胞介素(IL)-6、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白(TIM)-3、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)3是目前在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的研究重點(diǎn)，但在結(jié)直腸癌中的具體作用機(jī)制仍未明確。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化檢測(cè)在正常結(jié)直腸黏膜組織、結(jié)直腸腺瘤組織及結(jié)直腸腺癌組織中TIM-3、STAT3、IL-6蛋白的表達(dá)及與臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2015～2018年在遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科行結(jié)直腸癌根治術(shù)的70例結(jié)直腸腺癌患者蠟塊標(biāo)本、42例結(jié)直腸腺瘤患者標(biāo)本、10例正常結(jié)直腸黏膜標(biāo)本(遵從健康人體檢自愿從腸鏡下取黏膜組織活檢患者)，所有標(biāo)本有完整的病例資料、無放療、化療及惡性腫瘤史且行結(jié)直腸癌根治術(shù)并由病理科醫(yī)生診斷病理類型。70例結(jié)直腸癌標(biāo)本中男37例、女33例；年齡：≥60歲36例、<60歲34例；部位：結(jié)腸32例、直腸38例；腫瘤大?。骸? cm 41例、<5 cm 29例；浸潤(rùn)深度：T1+T2 25例、T3+T4 45例；分化程度：高分化7例、中分化44例、低分化19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期22例、Ⅲ+Ⅳ期48例。

1.2主要試劑 兔抗人TIM-3多克隆抗體、兔抗人STAT3多克隆抗體及兔抗人IL-6多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；多聚-L-賴氨酸、磷酸鹽緩沖液(PBS)、檸檬酸鹽緩沖液、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液等均購(gòu)自上?；蚩萍加邢薰荆煌ㄓ眯蜕窖蜓寮捌渌噭┚勺窳x醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科收集符合納入條件的蠟塊，將蠟塊3 μm連續(xù)切片，經(jīng)二甲苯透明試劑Ⅰ、Ⅱ分別10 min脫蠟、濃度梯度100%、95%、80%、70%、50%乙醇分別5 min水化、3%過氧化氫10 min清除內(nèi)源性過氧化物酶、檸檬酸鹽溶液(pH=6.0)抗原修復(fù)，冷卻后使用山羊血清封閉30 min，滴加一抗(兔抗人IL-6多克隆抗體1∶100，兔抗人TIM-3多克隆抗體1∶150，兔抗人STAT3多克隆抗體1∶200)過夜，第2天取出切片，復(fù)溫30 min，PBS沖洗3次，每次約10 min，加入適量二抗(兔鼠通用型)30 min，PBS沖洗3次，每次約10 min，DAB顯色(顯色劑A 1 000 μl：顯色劑B 40 μl)，蘇木素復(fù)染4 min，流水沖洗3 min，鹽酸酒精分化10 s，流水沖洗10 min，然后放入濃度梯度50%、70%、85%、95%、100%乙醇中，每次2 min進(jìn)行脫水，切片風(fēng)干后蓋片顯微鏡下讀取結(jié)果。

1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定 首先在100倍物鏡下觀察標(biāo)本，排除非特異性染色的區(qū)域后，找到陽性細(xì)胞著色最強(qiáng)的位置，將物鏡調(diào)整到400倍，在5個(gè)有表達(dá)性強(qiáng)的視野下，分別計(jì)數(shù)細(xì)胞的著色強(qiáng)弱(無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分)及陽性細(xì)胞百分率為陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比值(0分<5%，1分 6%～25%，2分 26%～50%，3分 51%～75%，4分>75%)，兩者相乘為0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為陽性，9～12分為強(qiáng)陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1各組TIM-3、STAT3、IL-6陽性率比較 TIM-3、 STAT3、IL-6陽性表達(dá)主要集中在細(xì)胞質(zhì)，呈黃色、黃棕色或棕色顆粒，在正常結(jié)直腸黏膜、結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸腺癌組織中TIM-3、STAT3、IL-6均有表達(dá)。TIM-3、STAT3、IL-6陽性率比較：結(jié)直腸腺癌組>結(jié)直腸腺瘤組>正常結(jié)直腸黏膜組(均P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 各組TIM-3、STAT3、IL-6表達(dá)情況(DAB,×400)

表1 各組TIM-3、STAT3、IL-6陽性率比較〔n(%)〕

2.2TIM-3、STAT3、IL-6與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系 結(jié)直腸腺癌組織TIM-3蛋白的表達(dá)情況與腫瘤直徑、患者年齡、性別以及腫瘤生長(zhǎng)部位均無關(guān)(P>0.05)，但與腫瘤的TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度和腫瘤的分化程度均相關(guān)(P<0.05)，TNMⅢ+Ⅳ期陽性表達(dá)率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=10.329，P<0.05)；腫瘤浸潤(rùn)深度T1+T2陽性表達(dá)率明顯低于T3+T4組(χ2=4.432，P<0.05)；低分化陽性率明顯高于中分化及高分化(χ2=7.638，P<0.05)。STAT3蛋白的表達(dá)與腫瘤大小、患者年齡、性別、浸潤(rùn)深度、分化程度及腫瘤生長(zhǎng)部位均無關(guān)(P>0.05)，但與腫瘤的臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，TNM Ⅲ+Ⅳ期陽性率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期(χ2=12.992，P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=8.767，P<0.05)。IL-6蛋白的表達(dá)與腫瘤大小、患者年齡、性別及腫瘤生長(zhǎng)部位均無關(guān)(P>0.05)，但與腫瘤的臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度和腫瘤的分化程度均相關(guān)(P<0.05)，TNM Ⅲ+Ⅳ期陽性表達(dá)率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期(χ2=17.60，P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=8.839，P<0.05)；腫瘤浸潤(rùn)深度T1+T2陽性表達(dá)率明顯低于T3+T4組(χ2=4.432，P<0.05)；低分化陽性表達(dá)率明顯高于中分化及高分化(χ2=12.454，P<0.05)。見表2。

表2 TIM-3、STAT3、IL-6蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系〔n(%)〕

2.3TIM-3、STAT3、IL-6在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)的相關(guān)性 有54例結(jié)直腸腺癌標(biāo)本STAT3和IL-6均陽性，10例IL-6陽性而STAT3陰性，2例STAT3陽性而IL-6陰性。4例IL-6和STAT3均陰性，Spearman相關(guān)性分析可知，TIM-3蛋白與STAT3蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.357P=0.002)。

3 討 論

TIM基因家族編碼的I膜蛋白即為TIM-3，位于染色體5q33.2〔4〕。在腫瘤微環(huán)境中，持續(xù)高表達(dá)的TIM-3分子的糖基化側(cè)鏈與其配體半乳凝素9結(jié)合后，一方面能促進(jìn)髓源抑制細(xì)胞(CD11b+Gr-1+MDSC和CD4+FoXP3+Treg)的增殖，另一方面特異性地降低轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞中表達(dá)的T盒即TIM-3和BAT-3結(jié)合后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)片段分離，并將抑制信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)片段，削弱T淋巴細(xì)胞的增殖，加速其衰竭并凋亡，從而抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答〔5～7〕。然而在結(jié)直腸癌中TIM-3分子遠(yuǎn)端的N-黏性末端可通過與癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子(CEACAM)1順式或反式結(jié)合，導(dǎo)致TIM-3與Bat3的結(jié)合，從而上調(diào)TIM-3表達(dá)，削弱了T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖〔8〕。Huang等〔9〕通過小鼠直腸癌模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)CEAAM1TIM-3細(xì)胞的比例遠(yuǎn)高于CD4T細(xì)胞。同時(shí)，CEACAM1可通過調(diào)節(jié)TIMP-3的表達(dá)而誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受，從而削弱結(jié)直腸腺癌患者免疫系統(tǒng)的抗腫瘤能力。在腫瘤患者免疫系統(tǒng)中固有免疫是第一道防線，Chiba等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腺癌患者的浸潤(rùn)性樹突細(xì)胞(DC)TIM-3的持續(xù)高表達(dá)，它與核酸競(jìng)爭(zhēng)與高遷移率蛋白(HMG)B1結(jié)構(gòu)域A盒競(jìng)爭(zhēng)，阻礙核酸與HMGB1的結(jié)合，因此抗原抗體復(fù)合物不能通過Toll樣受體(TLR)識(shí)別，導(dǎo)致IL受體相關(guān)激酶P將被阻斷，從而破壞HMGB1介導(dǎo)核酸進(jìn)入細(xì)胞的固有免疫，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡后由核酸釋放的免疫原性降低，抑制核酸介導(dǎo)的先天性抗腫瘤免疫反應(yīng)。同時(shí)持續(xù)高表達(dá)的TIM-3還可通過促使巨噬細(xì)胞M2型極化，抑制M1型極化，減弱巨噬細(xì)胞吞噬和殺傷效應(yīng)抑制大腸癌患者腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，造成大腸癌腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸〔11〕。Wang等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，通過阻斷TIM-3能提高機(jī)體固有免疫，從而在一定程度上增加機(jī)體的抗腫瘤能力。本實(shí)驗(yàn)提示在結(jié)直腸腺癌患者中TIM-3持續(xù)表達(dá)可能存在促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展或致癌的作用，且腫瘤的浸潤(rùn)程度越深、分化程度越差、分期越高伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸腺癌患者，TIM-3的表達(dá)陽性率越高。

STAT是一種細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，由生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等肽類配體激活〔13〕。STAT3是STAT家族中的一員，STAT3在白血病、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌等實(shí)體腫瘤及血液組織中持續(xù)表達(dá)。張國(guó)強(qiáng)等〔14〕通過免疫組化實(shí)驗(yàn)證明持續(xù)高表達(dá)的STAT3基因參與結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期相關(guān)。c-myc基因和細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1通過SH2結(jié)構(gòu)域和Src表達(dá)上調(diào)，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其增殖，促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展〔15～19〕。研究表明，IL-6作為STAT3的活化因子，通過與配體GP130特異性結(jié)合，激活JAK激酶同時(shí)磷酸化STAT3，促使JAK2/STAT3信號(hào)通路被激活，促進(jìn)結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的增長(zhǎng)〔20〕。同時(shí)JAK2/STAT3信號(hào)通路也可通過生長(zhǎng)因子(VEGF)促進(jìn)腫瘤新生血管生成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。此外STAT3不僅可直接調(diào)控VEGF，也可通過HIF-1α的表達(dá)間接促進(jìn)VEGF，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖。

IL-6主要由單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，其包括了184個(gè)氨基酸，擁有一段疏水信號(hào)(其包含28個(gè)氨基酸)及兩個(gè)含有潛在糖基化部分的N端，此外IL-6還擁有C端第4氨基酸鄰近區(qū)域及N端31-31氨基酸區(qū)域的兩個(gè)活動(dòng)中心〔21〕。IL-6主要作用為誘導(dǎo)T、B細(xì)胞的分化及作用和促進(jìn)造血功能等，但I(xiàn)L-6亦可抑制免疫系統(tǒng)，刺激腫瘤細(xì)胞新生血管的形成，參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。IL-6促使腫瘤發(fā)生發(fā)展的方式最主要為激活STAT3表達(dá)，其通過經(jīng)典途徑即IL-6R直接與配體gp130特異性結(jié)合和跨信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑即IL-6在不通過IL-6R與gp130特異性結(jié)合的情況下，直接與sIL-6R結(jié)合，形成sIL-6R/IL-6復(fù)合物，刺激細(xì)胞膜上gp130形成同源二聚體，激活JAK激酶同時(shí)磷酸化STAT3，促使JAK2/STAT3信號(hào)通路被激活，表達(dá)和轉(zhuǎn)錄靶基因，促進(jìn)結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的增長(zhǎng)及新生血管形成，削弱腺癌細(xì)胞的凋亡〔22～24〕。張曉芹等〔25〕通過免疫組化表明，結(jié)直腸癌細(xì)胞中STAT3的表達(dá)與IL-6的表達(dá)上調(diào)，并且呈正相關(guān)。