基于PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1通路分析沉默miR-664-3p對去卵巢骨質疏松大鼠的干預作用

胡廣 關智宇 張開偉

(貴州中醫藥大學第一附屬醫院骨科，貴州 貴陽 550001)

骨質疏松是臨床常見的骨科疾病，屬于系統性代謝性疾病，主要以骨密度降低、骨量減少、固位結構退化等為表現特征〔1,2〕。女性骨質疏松發病率高于男性，且多發于中老年絕經后婦女，因此又被稱為絕經后骨質疏松。絕經后骨質疏松與絕經后雌激素水平下降及生理性衰退等因素有關，是由多種因素導致骨重建速度降低、骨代謝失衡、骨微結構改變所致〔3,4〕。有研究表明，骨髓基質細胞增殖能力及分化成骨細胞能力在骨質疏松患者中明顯下降〔5〕。作為調控成骨細胞、破骨細胞功能喜好通路網絡中心，磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號對維持骨組動態平衡具有重要作用，而PI3K/Akt/糖原合成酶(GSK)3β/活化T細胞核因子(NFATc1)信號通路在破骨細胞分化、形成過程中具有重要意義〔6〕。miRNAs在骨質疏松中出現異常表達，但其是否能夠有效控制成骨分化及骨骼形成，仍值得深究〔7〕。本研究通過PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1通路觀察沉默miR-664-3p對去卵巢骨質疏松大鼠的干預作用。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取30只健康SD雌大鼠，來源于北京微通利華實驗動物技術有限公司。鼠齡8～13 w，平均鼠齡(10.5±3.1)w，體重228～267 g，平均體重(247.5±16.5)g。在相對溫度(35±2)℃，濕度35%～45%，12 h光照晝夜交替照明環境下喂養1 w，給予標準鼠科動物飼料，不限制飲水與飲食。本文研究獲得醫院倫理委員會批準。

主要試劑：兔抗小鼠骨鈣素抗體購自Dako公司；堿性磷酸酶(ALP)抗體購自碧云天公司；小鼠抗兔PI3K、Akt、GSK3β、NFATc1抗體購自BD公司；酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自慧嘉生物；骨密度檢測儀購自南京博克納自動化系統有限公司；Micro-CT購自無錫懷信生物醫藥科技有限公司。

1.2方法

1.2.1建模分組 隨機選取10只大鼠作為正常組，剩余20只建立去卵巢骨質疏松模型。對所有大鼠使用戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，俯臥位固定，去除大鼠卵巢組織，術后10 w檢測所有大鼠骨密度，對未發生骨質疏松的大鼠進行篩選。最終建模成功17只，將17只去卵巢骨質疏松模型大鼠隨機分為模型組9只，沉默組8只。沉默組大鼠使用10 mg/kg antago miR-664-3p灌胃干預，對正常組、模型組采用同等劑量的生理鹽水灌胃。各組大鼠連續干預10 w。

1.2.2蘇木素-伊紅(HE)染色 取大鼠左后肢全骨，置于10%中性甲醛溶液內加固，使用10%EDTA-NA緩沖液進行脫鈣處理，梯度乙醇脫水，使用石蠟縱向包埋，進行常規切片，使用HE染色，光學顯微鏡下進行病理觀察。

1.2.3全骨髓法體外培養骨髓基質細胞(BMSCs) 分離細胞，在37℃環境下，于0.5%CO2培養箱中進行培養，每3 d換液1次。當原代細胞集落處細胞密度達到密集狀態時，使用0.25%胰酶消化傳代。取每組第3代BMSCs，計數后將濃度調至4×104個/ml，培養基調整為1%FBS，鋪96孔。每組細胞設立復孔，于接種后0～6 d使用CCK-8對每組細胞450 nm波長處吸光值進行檢測，每次檢測3個復孔。

1.2.4檢測骨密度、股骨微結構 連續干預10 w后，將大鼠麻醉，對大鼠右側股骨密度進行檢測。對大鼠行Micro-CT掃描檢測骨微結構，骨折線上下各200層為掃描范圍，之后使用NRecon軟件對斷層圖像進行三維重建，使用CT Analyser軟件采集骨體積分數(BV/TV)、骨痂骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.2.5采用酶聯免疫吸附試驗對骨鈣素(OC)水平進行檢測 將待測標本置于室溫后，標記酶標板，制作標準品，然后取出試劑盒，按照1∶2比例對樣品進行稀釋，將標準品100 μl/孔和待測血清依次加入反應孔中，在37℃恒溫孵育箱內濕育2 h，后使用專用洗滌劑清洗3次，再加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)100 μl/孔，再次置于37℃孵育箱內濕育45 min，對反應板洗滌4次，于每孔加入TMB溶液100 μl/孔，再次置于孵育箱內濕育45 min，加入終止液100 μl/孔終止反應，在450 nm波長測定吸光度，經繪制標準曲線計算OC水平。

1.2.6免疫透射比濁法檢測ALP含量 取3個試管標記為空白管、測定管、標準管，隨后均加入300 μl緩沖液，在空白管、測定管、標準管中分別加入20 μl蒸餾水、20 μl血清、20 μl APL標準液。對3個試管均勻晃動后，放置常溫環境下5～10 min，使用分光光度計對其進行比色，在500 nm波長處以空白管調零下，記錄吸光度，最后對ALP水平進行計算。

1.2.7實時熒光定量PCR檢測法檢測miR-664-3p表達量 提取細胞總RNA，檢測RNA純度、含量，逆轉錄處理后獲得cDNA，使用Primer5.0軟件設計引物，采用2-△△Ct方法計算，內參U6。設置反轉錄反應條件：25℃ 10 min,40℃ 60 min,85℃ 5 min；設置擴增條件:94℃ 20 s、72℃ 30 s、60℃ 30 s,35個循環，采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的miR-664-3p表達量。miR-664-3p引物序列：上游引物：5'-TATTCATTTACTCCCCAGCCTA-3'，下游引物：5'-TATTCATTTATCCCCAGCCTACA-3'。

1.2.8Western印跡法檢測對各組PIK3、Akt、GSK3、NFATc1水平 采用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗標本，隨后裂解30 min，測定其蛋白濃度。取得20 μg/孔蛋白質進行電泳，同時加入蛋白緩沖液，10 min后把電轉膜放置于濃度10%牛奶中浸泡，常溫環境下封閉2 h。封閉后結合-抗孵育1 d，次日取出，使用TBST液進行沖洗，結合二抗。1 h后進行清洗、顯色，對蛋白PI3K、Akt、GSK3β、NFATc1表達進行檢測。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行重復測量數據方差分析、F檢驗、獨立t檢驗。

2 結 果

2.1去卵巢骨質疏松大鼠股骨微結構 正常組大鼠股骨微結構骨小梁厚度、數量均處于正常階段,骨小梁有成骨細胞排列。模型組大鼠股骨微結構骨小梁厚度明顯降低，骨小梁數量大幅度減少，骨髓腔變大，成骨細胞邊界模糊。沉默組大鼠股骨微結構骨小梁厚度較模型組有所增厚，骨小梁數量增多，骨髓腔變小，可見骨原細胞，但還未達到正常大鼠股骨微結構骨小梁厚度、數量。見圖1、圖2。

圖1 各組股骨微結構(×200)

圖2 各組骨組織病理(HE，×200)

2.2去卵巢骨質疏松大鼠模型骨細胞指數、骨密度 正常組骨細胞指數、骨密度均顯著高于模型組、沉默組(P<0.05)；模型組骨細胞指數、骨密度顯著低于沉默組(P<0.05)。見表1。

表1 各組骨細胞指數和骨密度及股骨微結構比較

2.3各組去卵巢骨質疏松模型大鼠股骨微結構 模型組及沉默組Tb.N、Tb.Th、BV/TV均顯著低于正常組，Tb.Sp高于顯著正常組(P<0.05)；沉默組Tb.N、Tb.Th、BV/TV均顯著高于模型組；Tb.Sp顯著低于沉默組(P<0.05)。見表1。

2.4血清OC、ALP水平比較 模型組OC、ALP水平均顯著高于正常組(P<0.05)；沉默組血清OC、ALP水平顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清OC、ALP水平及miR-664-3p、PI3K、Akt、GSK3β、NFATc1表達

2.5各組miR-664-3p、PI3K、Akt、GSK3β、NFATc1表達 沉默組及模型組miR-664-3p、PI3K、Akt、NFATc1表達均顯著高于正常組(P<0.05)，GSK3β表達顯著低于正常組(P<0.05)；沉默組miR-664-3p、PI3K、Akt、NFATc1表達均顯著低于模型組，GSK3β表達顯著高于模型組(P<0.05)。見表2，圖3。

圖3 各組miR-664-3p、PI3K、Akt、GSK3β、NFATc1蛋白表達

3 討 論

近年來，隨中國人口老齡化加重，骨質疏松發病率呈逐年上升趨勢〔8,9〕。卵巢功能退化、雌性激素水平下降是導致絕經后骨質疏松發生的主要原因。絕經后婦女骨質疏松屬于一種高轉化型骨質疏松，臨床研究顯示，去卵巢建立的骨質疏松模型是目前臨研究絕經后骨質疏松的經典方法〔10，11〕。本文研究中以SD雌性大鼠去卵巢后建立去卵巢骨質疏松大鼠模型，模型組大鼠骨質密度明顯降低證明造模成功。

骨密度、骨細胞指數是診斷卵巢骨質疏松癥狀及評價骨質疏松性骨折治療效果的臨床常用指標〔12，13〕。龔慶等〔14〕研究顯示，去卵巢骨質疏松模型大鼠骨密度下降，對其進行有效的干預后骨密度上升，說明骨密度和卵巢骨質疏松癥狀有著密切的關聯。本文研究中發現，去卵巢骨質疏松模型大鼠骨密度明顯下降，與上述一致。對其進行沉默miR-664-3p干預后發現，去卵巢骨質疏松大鼠骨密度出現明顯的提升，說明miR-664-3p沉默后，能夠改善去卵巢骨質疏松大鼠骨密度和骨細胞指數，對去卵巢骨質疏癥狀有著一定的改善作用。

OC是一種非膠原酸性糖蛋白，是一種維生素K依賴性鈣結合蛋白，其主要是由成骨細胞、成牙質細胞合成來。OC在調節骨鈣代謝中有著重要的作用，是一種研究骨代謝的生化標志物之一〔15，16〕。ALP是一種廣泛分布于人體肝臟、骨骼、胎盤等組織經肝臟向膽外排出的一種酶，在臨床上ALP主要用于對骨骼、肝膽疾病的鑒別診斷〔17〕。本文研究說明沉默miR-664-3p能夠通過調節OC、ALP水平，而起到的治療去卵巢骨質疏松效果。

臨床研究表明，在所有的生理病理過程中miRNA幾乎全部參與，在骨質疏松中其存在異常表達〔18〕。研究證實，miR-664-3p參與ICA介導的成骨細胞分化，miR-664-3p能夠有效抑制成骨細胞分化，其沉默表達引起PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路表達下降，進而導致骨質疏松的發生〔19〕。PI3K/Akt信號通路是細胞增殖、轉移、黏附及死亡過程中的重要調節者，在正常的生理條件下，PI3K/Akt信號通路能夠選擇性的影響成骨、破骨細胞的生理功能，能夠維持骨組織的動態平衡。RANKL、M-CSF兩個因子在破骨細胞的形成過程中有關鍵性作用，其中RANKL因子是破骨細胞形成的主要調節者。PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路在RANKL引起的破骨細胞形成和分化中起重要作用〔20，21〕。本文研究結果顯示，沉默miR-664-3p干預對PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路進行調控可能是抑制骨質疏松的一種潛在機制。

綜上，沉默miR-664-3p干預可能通過調控PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路促進骨髓基質細胞的增殖、抑制層骨細胞的凋亡，從而發揮抑制骨質疏松的作用。