克洛己新干混懸劑通過PI3K/AKT信號通路改善銅綠假單胞菌誘發的小鼠急性肺炎

李燕梅 郝金平 郭永林 程環

(1菏澤市立醫院，山東 荷澤 274000；2菏澤市婦幼保健院)

銅綠假單胞菌(PA)因其生長過程中會產生綠色水溶性色素，使膿液呈現綠色，因此又稱其為綠膿桿菌〔1〕。PA主要存在于人體的皮膚、呼吸道及消化道內，其生長條件要求較低，繁殖能力較強，因此會導致人體多系統、多部位和多臟器發生感染，嚴重時危及患者生命安全〔2〕。PA是造成肺炎的主要致病菌種，由該種病菌感染的肺炎致死率較高。PA肺炎是呼吸內科常見疾病，但因PA的膜通透性較高而對多種抗生素耐藥，給臨床治療PA肺炎帶來了很大的困難〔3〕。磷酸肌醇3激酶(PI3K)/AKT是細胞進行信號傳導的重要途徑，涉及炎癥反應和免疫應答〔4〕。Yang等〔5〕研究表明抑制PI3K/AKT信號通路的激活可阻止甲型流感病毒感染后的肺炎鏈球菌再感染；Yu等〔6〕研究顯示，廣藿香醇通過抑制PI3K/AKT和細胞外調節蛋白激酶(ERK)/促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路抑制了甲型流感病毒的體外繁殖，同時通過鼻內給藥可顯著減輕肺炎小鼠的癥狀并提升肺炎小鼠的存活率。克洛己新干混懸劑是由鹽酸溴己新和頭孢克洛復合而成的新制劑，其在抗感染、抗菌的基礎上進行化痰治療。現階段，克洛己新干混懸劑雖在臨床上取得了較好的治療效果，但對臨床用藥的安全性和其具體作用機制尚不清楚，因此本研究將在細胞水平上探究克洛己新干混懸劑的細胞毒性，并通過構建PA肺炎動物模型探究其治療效果和作用機制。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑 60只雄性昆明小鼠，4周齡，體重(14.0±1.0)g，購于國家藥品和生物制品控制研究所實驗動物中心，其中對照組12只，模型組48只。NHBE、BEAS-2B和A549細胞系購自美國模式培養物研究所。克洛己新干混懸劑(編號：B14200032850，批準文號：國藥準字H20051142)購自江蘇正大清江制藥有限公司。DMEM培養基、F12培養基、瓊脂糖培養基、青霉素和鏈霉素及L-谷氨酰胺均購自美國Gibco公司。胎牛血清購自美國Thermo Scientific公司。人重組腫瘤壞死因子(TNF)-α細胞因子購自以色列PEPROTECH公司。PA標準株(ATCC27853)由菏澤市立醫院檢驗中心提供。白細胞介素(IL)-6、IL-8、TNF-α和RANTES酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自南京生航生物技術有限公司。PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和GAPDH一抗及HRP標記的IgG二抗均購自德國CST公司。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、RIPA裂解液和ECL試劑盒均購自碧云天生物技術公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 NHBE和BEAS-2B細胞在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中培養。A549細胞置于含10%胎牛血清和2 mmol/L L-谷氨酰胺的F12培養基中培養。所有細胞置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中進行培養。

1.2.2細胞炎癥模型構建 NHBE、BEAS-2B和A549細胞以2×106個/ml分別接種于25 cm2的培養瓶中，細胞貼壁融合>50%時更換新鮮培養基，加入10 ng/ml的TNF-α刺激2 h后收集細胞用于后續實驗。

1.2.3四甲基偶氨唑藍(MTT)比色法檢測細胞活力 取對數生長期的細胞用0.25%的胰酶消化后配制成細胞懸液(5×104個/ml)并接種至96孔板，每孔180 μl。孵育過夜后加入0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 mg/ml的克洛己新干溶液。培養24 h后向各孔中加入10 μl的MTT溶液(5 g/L)繼續孵育4 h。棄除上清液后加入100 μl的DMSO振蕩10 min。使用酶標儀測定各孔在490 nm處的吸光光度值，并計算細胞活性。

1.2.4PA肺炎小鼠模型構建 將標準菌株ATCC27853使用瓊脂糖培養基調整濃度至0.5個麥氏單位(≈1.3×108CFU/ml)。切開模型組小鼠氣管，注入含50 μl PA的瓊脂糖珠懸液后立即豎起小鼠保持2 min，菌液充分流入肺后小鼠有類似嗆咳反應。對照組小鼠制作切口不接種PA。1 w后小鼠傷口愈合后進行后續實驗。本研究中所涉及的動物實驗均符合美國國立衛生研究院關于對實驗動物使用的指導原則。

1.2.5小鼠實驗 對照組小鼠傷口愈合后收集靜脈血，處死小鼠后收集小鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液(BALF)。模型組小鼠接種PA 1 w后通過口服克洛己新干混懸劑，根據口服克洛己新干混懸劑的劑量分為低濃度組〔10 mg/(kg·d)〕、中濃度組〔30 mg/(kg·d)〕和高濃度組〔50 mg/(kg·d)〕。口服克洛己新干混懸劑10 d，收集小鼠靜脈血后處死小鼠并收集肺組織和BALF。小鼠靜脈血收集后存于-20℃用于后續實驗。小鼠BALF收集后測量其體積。將收集的小鼠肺組織稱重后置于80℃的恒溫干燥箱中過夜，獲取干燥的肺組織后稱重。通過公式計算小鼠肺組織濕/干重比(濕/干重比=濕肺重量/干肺重量)。

1.2.6ELISA檢測驗證因子表達水平 向酶標板各孔中加入稀釋后的IL-6、IL-8、TNF-α和RANTES抗原100 μl，置于37℃下4 h。棄除上清液后使用5%胎牛血清封閉40 min。加入對應酶標抗體后在按照ELISA試劑盒說明書在450 nm處測定細胞、小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α和RANTES吸光光度值，根據各因子的標準曲線計算其水平。

1.2.7HE染色檢測小鼠肺組織病理學變化 將收集的小鼠肺組織使用預冷的4%多聚甲醛固定48 h后使用梯度濃度的酒精脫水，隨后用石蠟進行包埋。將石蠟包埋后的組織進行切片(5 μm)后放置于載玻片上，在80℃的恒溫干燥箱中過夜。使用二甲苯去除組織表面的石蠟后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3 次，切片使用蘇木素染色液染色3 min后再使用伊紅染色液染色3 min。將染色后的切片風干后使用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察后拍照。

1.2.8Western印跡檢測PI3K/AKT信號通路活性 使用RIPA裂解液提取細胞和小鼠肺組織中的總蛋白。將30 μg的蛋白質樣品使用SDS-PAGE轉移至硝酸纖維素膜上，在室溫下使用脫脂奶粉封閉30 min。使用抗PI3K(1∶1 000)、抗p-PI3K(1∶1 000)、抗AKT(1∶1 000)、抗p-AKT(1∶1 000)和抗GAPDH(1∶1 000)在4℃條件下孵育過夜。孵育過夜后使用HRP標記的IgG抗體繼續在室溫條件下孵育1 h。通過ECL試劑盒顯影后拍照，通過Imagej軟件對條帶灰度值進行測定。

1.3統計學處理 使用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析。使用Graphpad Prism8.0軟件對數據進行圖片繪制。

2 結 果

2.1克洛己新干混懸劑對人肺細胞和PI3K/AKT信號通路影響 MTT結果顯示，克洛己新干混懸劑濃度在0.1～3.0 mg/ml的濃度內對A549細胞未表現出明顯的細胞毒性。通過TNF-α刺激A549細胞以誘導細胞產生炎癥反應。ELISA結果顯示，TNF-α誘導后細胞內IL-6和IL-8的表達水平相對于對照組顯著上升(P<0.05)。高濃度組、中濃度組和低濃度組IL-6和IL-8水平均較TNF-α組明顯降低(P<0.05)。Western印跡檢測結果顯示，TNF-α誘導后細胞內PI3K/AKT信號通路被激活(P<0.05)，高濃度組、中濃度組和低濃度組的克洛己新干混懸劑處理后細胞內PI3K/AKT信號通路的激活受到明顯抑制(P<0.05)，見表1、圖1。

圖1 Western印跡檢測克洛己新干混懸劑對PI3K/AKT信號通路影響

表1 各組IL-6、IL-8水平比較

2.2PI3K/AKT信號通路對人肺細胞炎癥的影響 與TNF-α組相比，TNF-α+LY294002組p-PI3K、p-AKT信號通路蛋白顯著降低(均P<0.05)。見圖2，表2。表明使用LY294002后A549細胞內IL-6和IL-8水平明顯降低。

圖2 Western印跡檢測PI3K/AKT信號通路對人肺細胞炎癥的影響

表2 抑制PI3K/AKT信號通路對人肺細胞PI3K/AKT信號通路蛋白的影響

2.3克洛己新干混懸劑對PA肺炎小鼠肺部炎癥和肺水腫的影響 HE染色結果顯示，接種PA后模型組小鼠肺組織中觀察到明顯的膿性滲出物，中濃度組、高濃度組克洛己新干混懸劑給藥10 d后可明顯減少PA肺炎小鼠肺組織的膿性滲出物，低濃度組克洛己新干混懸劑給藥并未表現出這種效果，見圖3。TNF-α組BLAF體積、濕重/干重、IL-6、IL-8、TNF-α、RANTES水平均顯著高于對照組(均P<0.05)；低、中、高濃度組上述指標水平均顯著低于TNF-α組，且至濃度依賴性(均P<0.05)。見表3。

圖3 各組肺組織的病理學觀察(HE，×40)

表3 各組肺部炎癥和肺水腫影響指標水平比較

2.4克洛己新干混懸劑對PA肺炎小鼠PI3K/AKT信號通路活性的影響 TNF-α組p-PI3K和p-AKT水平顯著高于對照組(P<0.05);與TNF-α組相比，低濃度組、中濃度組、高濃度組p-PI3K和p-AKT水平顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)，見表4，圖4。

表4 克洛己新干混懸劑對PA肺炎小鼠PI3K/AKT信號通路蛋白的影響

圖4 克洛己新干混懸劑對PA肺炎小鼠PI3K/AKT信號通路活性的影響

3 討 論

研究表明，PA是院內感染的主要病原體之一，其外毒素會抑制蛋白質的合成，促使組織壞死，并引起白細胞減少、酸中毒、循環衰竭等，常發生在免疫力較為低下的人群中，同時也是造成肺炎的主要致病菌種〔7〕。同時PA誘發的肺炎是一個急性炎癥反應，會導致肺損傷和一系列呼吸系統損傷，嚴重時可危及患者生命〔8〕。

PI3K/AKT信號通路在多種癌癥中發揮促癌作用〔9〕，在多種慢性疾病中發揮促炎作用〔10，11〕。研究顯示，miR-4485通過PI3K/AKT/mTOR途徑改善了H1N1誘發的肺部損傷〔12〕，另外Psg-1的缺乏會導致PI3K/AKT信號通路激活誘發小鼠肺炎〔13〕。本研究結果表明PI3K/AKT信號通路參與了肺部細胞的炎癥反應。有研究表明，PA的鞭毛運動能夠激活PI3K/AKT信號通路的激活，提示PI3K/AKT信號通路可能是PA誘發肺炎的重要途徑〔14〕。本研究表明克洛己新干可能通過PI3K/AKT信號通路減輕PA誘導的肺炎小鼠的肺損傷。

臨床藥理學研究表明，服用克洛己新干混懸劑后可能對消化道、肝臟和神經系統等產生一定的副作用〔15〕。但由于本研究實驗室條件和時間限制，沒有研究口服克洛己新干混懸劑對小鼠的肝功能和消化系統功能的影響，因此在后續的研究中我們將著重探究克洛己新干混懸劑對小鼠肝功能和消化系統功能的影響。綜上，克洛己新干混懸劑可通過PI3K/AKT途徑在體外有效抑制炎癥細胞中炎癥因子的表達，也可通過PI3K/AKT途徑顯著降低PA肺炎小鼠的肺損傷和肺水腫情況，并顯著抑制PA肺炎小鼠血清炎癥因子的表達。