腎炎康復片對糖尿病腎病小鼠糞便中短鏈脂肪酸的調節作用*

王曉麗 ，李春霞 ，陳倩 ，王佳 ，王濤 ，陳曉鵬

（1.天津中醫藥大學，組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.天津同仁堂集團股份有限公司，天津 300385）

腸道菌群被認為是人體內不可或缺的“器官”，其代謝產物如短鏈脂肪酸（SCFAs）也被證實生物學作用顯著。SCFAs主要包括碳原子數小于6的、有揮發性且溶于水的游離脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸、異戊酸。現有研究表明SCFAs在協調腸道穩態、葡萄糖功能、食欲、能量代謝的調節、炎癥和免疫能力以及腫瘤和結腸癌等方面有積極的作用[1]。有研究表明SCFAs可以促進下游因子的分泌[2]，如胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和肽YY（PYY），其會促進腸道的糖異生作用并且能夠降低血糖水平。另有研究顯示SCFAs可以刺激瘦素的表達，還可通過G蛋白偶聯受體抑制脂肪細胞的脂解作用，并激活AMP蛋白激酶（AMPK）是主要的細胞燃料指標和代謝穩態的主要調節者[3-4]。丙酸鹽和丁酸鹽激活腸道糖異生過程主要通過腸-腦神經回路的作用，以此來降低體質量并控制葡萄糖的代謝[5]。因為SCFAS是免疫應答的介質，所以能夠增加外周血單核細胞（PBMCs）抗炎細胞因子的生成，而且通過促進外周調節性T細胞（Treg）分化過程，丁酸和丙酸還可以維持免疫穩態[6]。

在中國，中藥治療糖尿病及其并發癥有著悠久的歷史。愈來愈多的研究表明，中藥可以通過多成分、多途徑、多靶點治療糖尿病并發癥，其中，中藥復方腎炎康復片對糖尿病腎病的治療作用日漸受到關注。腎炎康復片是源于《金匱要略》中的腎氣丸的演變方[7]，方中包含人參、西洋參、地黃、山藥、杜仲（炒）、白花蛇舌草、黑豆、益母草、丹參、土茯苓、澤瀉、白茅根、桔梗，其主要功效是養陰益氣，健脾補腎，清解余毒。主治屬于氣陰兩虛，脾腎不足，毒熱未清的慢性腎小球腎炎，主要病理表現為神疲乏力、腰酸腿軟、面浮肢腫、頭暈耳鳴、蛋白尿、血尿等。臨床證據表明[8-9]腎炎康復片與西藥聯用對糖尿病腎病的病理表現有較好的改善作用。并且課題組前期實驗生理指標檢測時發現[10]，db/db小鼠相比于正常小鼠，會出現糖尿病腎病的相關癥狀，且經腎炎康復片和二甲雙胍干預后可明顯減輕上述癥狀。

本研究從腸道菌群的代謝產物SCFAs的含量測定出發，尋找腎炎康復片干預糖尿病腎病的微生態治療靶點，以期闡明基于腸道微生態的腎炎康復片治療糖尿病腎病作用機制。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 7890B-7000D氣質聯用系統（GC-MS/MS，Agilent，美國），5424R 離心機（30×1.5/2.0 mL，Eppendorf，德國），MM400 球磨儀（Retsch），AS60/220.R2電子天平，MIX-200多管渦旋振蕩器（上海凈信，中國），KQ5200E超聲清洗儀（昆山舒美，中國）。乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸、2-甲基戊酸、甲基叔丁基醚（色譜純，CNW），異戊酸（aladdin，中國），磷酸（上海滬試，中國）。

1.2 樣品的采集和制備

1.2.1 樣品的采集 由南京大學動物模型研究中心提供的7周齡2型糖尿病BKS-Leprem2Cd479/Gpt小鼠[db/db 小鼠，體質量（40±2）g，無特定病原體]32只和正常小鼠[m/m 小鼠，體質量（18±2）g，無特定病原體]8只，許可證編號：SCXK2018-0008，將所有小鼠飼養在溫度和濕度可控的實驗室（室溫：22℃，濕度：60%），光照/黑暗周期為12 h，可自由進食和飲水，所有實驗方案均嚴格遵守中國科學技術部發布的《實驗動物的護理指南》（2006）以及天津中醫藥大學動物使用和護理委員會頒發的《實驗動物的使用護理指導意見》（IRM-DWLL-2019033）。課題組檢測實驗小鼠的生理指標時發現[10]，在體質量方面，db/db小鼠明顯高于正常小鼠；其次在腎臟質量指數方面，與正常小鼠相比，db/db小鼠表現出更低的腎臟質量指數；在攝食和飲水方面，db/db小鼠的攝食和飲水量明顯高于正常小鼠；并且db/db小鼠的空腹血糖狀態和HbA1c的水平明顯高于正常小鼠；同時db/db小鼠的尿量、微量白蛋白（MALB）、尿白蛋白肌酐比值（UACR）也明顯增加。說明db/db具有糖尿病腎病的相關癥狀，db/db小鼠后期可自發形成糖尿病腎病的模型。

在對所有動物進行適應性喂養1周后，從db/db小鼠的眼底靜脈叢中抽取0.2 mL血液以檢測血糖水平。將它們隨機分為4組，每組8只：模型組，腎炎康復片高、低劑量組和二甲雙胍組，并將年齡匹配的m/m小鼠指定為正常組。腎炎康復片高劑量組的劑量為2 g/kg，低劑量組的劑量為1 g/kg，腎炎康復片低劑量組的劑量是根據2020年《中國藥典》提供的人類臨床劑量確定的。二甲雙胍組的劑量為200 mg/kg。給藥后3個月，將每只小鼠置于代謝籠中，收集24 h糞便，記錄質量，并將其置于-80℃的冰箱中用于后期實驗分析。

1.2.2 樣品的制備 1）稱取樣本20 mg于2 mL的EP管中，加入1 mL磷酸（0.5%v/v）溶液，加入1顆小鋼珠，20 Hz下球磨儀10 s，重復2次，渦旋10 min混勻（所有渦旋操作都將渦旋儀頻率調到最大），再冰浴下超聲5 min。2）12 000 r/min、4℃條件下離心10 min（離心半徑=6 cm，下同），取上清液 100 μL 加入到對應的已編號的1.5 mL離心管中，加入500 μL含內標（2-甲基戊酸）的甲基叔丁基醚溶劑，渦旋3 min。冰浴下超聲5 min；之后在12 000 r/min、4℃條件下離心10 min。3）離心完后吸取上層清液200 μL到編號有玻璃內襯管的進樣瓶中，-20℃冰箱保存，待GC-MS/MS分析。

1.3 標準品溶液的配制及標準曲線的建立 配制0.005、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、5、8、10 和20 μg/mL不同濃度的標準品溶液，獲取各個濃度標準品的對應定量信號的質譜峰強度數據；以外標與內標濃度比（Concentration Ratio）為橫坐標，外標與內標峰面積比（Area Ratio）為縱坐標，繪制不同物質的標準曲線。

1.4 色譜-質譜條件 色譜條件為色譜柱：DBFFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣；流速為1.2 mL/min；采用分流模式，進樣口溫度為200℃，分流比為1∶1；升溫程序：起始溫度90℃保持1 min；以25℃/min升至100℃；以20℃/min升至150℃；以25℃/min升至200℃，保持0.5 min，后運行 3 min；進樣量為 2 μL。

質譜條件為離子源：EI電子源；掃描模式：MRM采集參數見表1；電子能量70 eV；傳輸線溫度230℃；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃。

表1 MRM采集參數表Tab.1 MRM acquisition parameter table

1.5 方法學考察 精密度：精密吸取混合對照品溶液，在“氣相色譜-質譜條件”項條件下，連續進樣3 d，每日6次，記錄各成分的峰面積，計算相對標準偏差（RSD%）；加樣回收率：精密稱取樣品，分別按已知質量分數的80%、100%、120%加入7種SCFAs對照品，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，在“1.4”項條件下分析，記錄各成分的峰面積，計算加樣回收率平均值。

1.6 樣本質控分析 以混合標準溶液作為質控樣本（QC），在儀器分析過程中，每隔10個檢測分析樣本插入1個QC樣本，通過對同一質控樣本質譜檢測分析的總離子流色譜圖（TIC）進行重疊展示分析，可以判斷數據檢測期間儀器的穩定性。

1.7 SCFAs的含量測定 將檢測到的所有樣本的積分峰面積比值代入標準曲線線性方程進行計算，進一步帶入計算公式計算后，最終得到實際樣本中該物質的絕對含量數據。

V1：磷酸體積（μL）；c：樣本中積分峰面積比值代入標準曲線得到的濃度值（μg/mL）；V2：上清液體積（μL）；V：樣品提取過程中加入提取液的體積（μL）；m：稱取的樣本質量（g）。

1.8 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件分析數據，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Pearson線性相關與回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 樣本的質控分析 混合標準品的TIC圖分析顯示該實驗檢測得到的總離子流圖重疊性高，見圖1，即保留時間和峰強度均一致，表明此項目檢測期間儀器穩定，為數據的重復性和可靠性提供了重要的保障。并且從圖中可見SCFAs的色譜峰分離較好，峰形尖銳對稱，能夠對各代謝物進行質譜定量。

圖1 混標溶液的TIC重合圖Fig.1 TIC coincidence diagram of mixed standard solution

2.2 線性關系的考察 以外標與內標濃度比為橫坐標，外標與內標峰面積比為縱坐標，繪制不同物質的標準曲線。得到線性回歸方程。各待測物含量在線性范圍內的線性良好，相關系數r2均大于0.998 1，滿足檢測需要。方法的線性回歸方程、相關系數及線性范圍見表2。

表2 7種短鏈脂肪酸的線性回歸方程、相關系數及線性范圍Tab.2 Linear regression equation，correlation coefficient and linear range of 7 kinds of short-chain fatty acids

2.3 方法學考察 利用混標溶液對檢測過程的儀器的精密度進行考察。顯示其精密度RSD<6.17%；選取1組樣本按樣本含量的80%、100%、120%加標量進行加樣回收率實驗，實驗結果見表3，結果顯示其平均回收率在90%～101%之間，說明實驗過程中儀器穩定，數據可靠。

表3 精密度和加樣回收率Tab.3 Precision and sample recovery rate

2.4 含量的測定 將檢測到的所有樣本的積分峰面積比值代入標準曲線線性方程進行計算，進一步帶入計算公式計算后，最終得到實際樣本中該物質的絕對含量數據。

2.5 統計學分析 將獲得的各SCFAs的含量進行統計學分析，結果表明經腎炎康復片和二甲雙胍的干預可不同程度地降低SCFAs的含量，并且統計學結果顯示與模型組相比，給藥組的丙酸含量顯著降低（P<0.05）。見圖3。

圖2 糞便樣品TIC圖譜Fig.2 TIC spectrum of fecal sample

圖3 腎炎康復片干預對丙酸含量的影響Fig.3 Effect of Shenyan Kangfu Tablets intervention on the content of propionic acid

3 討論

前期課題組實驗結果表明，糖尿病腎病小鼠的腸道微生態發生了嚴重的紊亂[10]；本實驗發現與給藥組相比所測的7種SCFAs的含量相較于模型組都有降低的趨勢，其中丙酸的降低趨勢具有統計學意義；這一結果與腸道菌群豐度的研究中腎炎康復片可以降低擬桿菌門的相對豐度密切相關。

丙酸主要是由腸道菌群中的優勢菌群擬桿菌門參與代謝生成的，經結腸吸收以后由肝臟代謝參與糖異生并用作能量來源[11-12]，因此在能量代謝中發揮著重要作用，且對體內的炎癥反應具有不可替代的作用。Bartolomaeus等[13]研究發現，在血管緊張素Ⅱ干預的小鼠高血壓模型中，丙酸鹽可以減弱多種T細胞對血管緊張素Ⅱ的應答，如輔助性T細胞17的減少，且丙酸鹽發揮依賴于調節性T細胞平衡輔助性T細胞17對血管緊張素Ⅱ引起的效應因子的反應，從而發揮降低血壓等作用。SCFAs可通過抑制核轉錄因子-κB（NF-κB）通路抑制炎癥細胞分泌白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性因子[14-15]。所以依此來推斷，丙酸可能在糖尿病腎病機體中通過調節異常的能量代謝過程和減緩腎臟的炎癥反應來減輕糖尿病腎病的病理表現。

糖尿病腎病患者體內存在嚴重的腸道菌群紊亂可導致擬桿菌門的相對豐度降低，導致丙酸的生成量減少，從而對宿主多種生理過程產生重要的影響。腸道菌群主要由4大類菌門組成，厚壁菌門與擬桿菌門占主導，還包括變形菌門及放線菌門[11，16]。常見產生SCFAs的菌群主要為厭氧菌，包括擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、梭菌屬、鏈球菌屬等。本課題組的前期研究[10]發現經腎炎康復片干預的db/db小鼠在16S rDNA檢測中，二甲雙胍和腎炎康復片處理可顯著降低擬桿菌門的相對豐度，而變形桿菌門的相對豐度并沒有明顯變化。擬桿菌和變形桿菌的相對豐度與小鼠的HbA1c水平、MALB和UACR呈顯著的正相關。HbA1c是通過緩慢、持續及不可逆的糖化反應形成，其含量的多少取決于血糖濃度以及血糖與血紅蛋白接觸時間，被用作糖尿病控制的監測指標；MALB可作為全身性或局部炎癥反應的腎功能指標；UACR是用于監測尿蛋白排出情況的一種新的可靠方法。并且將擬桿菌門的變化趨勢與小鼠血液中的炎性因子NF-κB、TNF-α和IL-1β作相關性分析時發現這兩者呈顯著的正相關關系。短鏈脂肪酸的含量測定結果顯示腎炎康復片可降低丙酸的含量，與腎炎康復片可使擬桿菌門的豐度降低結果是一致的，由此推出，各生理指標的變化與丙酸含量的降低有密不可分的關系的。

由上述結果可以得出，腎炎康復片改善糖尿病腎病的作用機制之一可能是改善腸道菌的代謝紊亂，降低擬桿菌的相對豐度，不僅會導致丙酸的生成減少，還可以抑制炎性因子的表達，回調機體的病理狀態。