白藜蘆醇通過PI3K/Akt信號通路協同5-氟尿嘧啶對結腸癌細胞的抑制作用

崔勇和，沈先敏

（湖北文理學院附屬醫院，襄陽市中心醫院，襄陽 441021）

結腸癌是全球第3位常見的惡性腫瘤，病死率較高[1]。針對每位患者腫瘤類型、分期及身體健康情況，其治療方法的選擇也有較大差異。目前，結腸癌最常見的治療方法包括手術、放療和化療[2]。然而，每種治療方式都存在潛在的風險、益處和不良反應，從而迫切需要開發治療該疾病的新策略。

5-氟尿嘧啶（5-FU）是極其常見治療結腸癌的化療藥物之一[3]。5-FU作為一種常見抗腫瘤藥物，也存在耐藥現象[4]。因此，5-FU與其他藥物聯合使用，可以提供一種更有效的方法，增強腫瘤細胞化療敏感性，同時降低對正常細胞的毒性。

白藜蘆醇（RES）是一種植物抗毒素，存在于多種植物中（如葡萄、花生和漿果）；已有證據表明，RES可以防治多種疾病，包括結腸炎和結腸癌[5-6]。已有研究指出RES可通過抑制磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路降低肝癌細胞的增殖和遷移[7]。本實驗嘗試在體外研究5-FU聯合RES對人結腸癌SW620細胞的抗腫瘤活性，并觀察其作用的分子機制。

1 材料及方法

1.1 主要材料及試劑 RES購自Sigma公司，批號：492-37-10；DMEM 培養基、胎牛血清（FBS）購自英國Gibco公司；CCK8試劑盒購買于北京智杰方遠科技有限公司，批號：WST-8；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購買于武漢巴菲爾生物有限公司，批號：C1062S；p-p85、p-110β、p-PDK1、p-Akt、Akt、Cle-caspase 9、Cle-caspase 7 和 Cle-PARP 抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養及藥物處理 結腸癌SW620細胞來源于武漢巴菲爾生物有限公司，采用DMEM完全培養液（含10%FBS、1%的100U/mL青霉素和100g/mL鏈霉素）孵育細胞，培養溫度37℃、CO2濃度為5%。待細胞生長至瓶底的90%左右，便可進行傳代培養。取對數期細胞進行后續實驗，RES處理細胞濃度為 5、10、20、40 μmol/L，5-FU 處理細胞濃度為25、50、100、150 μmol/L，RES 和 5-FU 聯合處理濃度分別為40、50 μmol/L，干預細胞時間為24 h。

1.3 細胞活性實驗 收集各組細胞，PBS清洗細胞一遍，每孔加入10 μL的CCK8試劑，繼續培養2 h后，在450 nm波長處檢測每孔吸光度OD值，并計算細胞相對活力。細胞相對活力（%）=藥物組OD值/對照組A值×100%。

1.4 細胞克隆實驗 收集各組細胞，倒置顯微鏡觀察細胞形態，并拍照。并隨機選擇10個視野，計數細胞，計算平均值作為細胞的克隆數。

1.5 細胞凋亡檢測 收集各組細胞，PBS清洗2次，PBS重懸后，分別加入Annexin-V FITC和PI處理細胞（按照試劑盒操作說明書進行），最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗 收集各組細胞，PBS清洗細胞3次，裂解、超聲破碎、12 000 r/min離心12 min后收集上清（離心半徑=20 cm），BCA試劑盒測定上清蛋白濃度。每個樣本上樣50 μg進行凝膠電泳，待蛋白完全分離后進行轉膜實驗。結束后加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1 h后，分別加入對應一抗抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000）4℃反應過夜。次日TBST洗膜3次后加入HRP標記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶3000），室溫反應1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL試劑顯影后進行蛋白條帶灰度值分析。

1.7 PI3K抑制劑LY294002對SW620細胞生長的影響 取對數期細胞，接種于6孔板，將細胞分為對照組、LY294002 （2 μmol/L）、RES+5-FU 組和LY294002+RES+5-FU組。首先采用LY294002預處理SW620細胞8 h，然后采用40 μmol/L的RES和50 μmol/L的5-FU處理細胞24 h，最后檢測細胞活力、克隆數及凋亡率。

1.8 PI3K過表達對SW620細胞生長的影響 取對數期細胞，接種于6孔板，將細胞分為對照組、PI3K mimics組、RES+5-FU組和PI3K mimics+RES+5-FU組。將PI3K mimics質粒轉染SW620細胞16 h，然后采用 40 μmol/L的RES和 50 μmol/L的 5-FU 處理細胞24 h，最后檢測細胞活力、克隆數及凋亡率。

1.9 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件統計，實驗數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RES增強5-FU對SW620細胞增殖的抑制作用 不同濃度 RES（5～40 μmol/L）處理 SW620 細胞24h，各濃度藥物均能夠明顯抑制細胞活力（P<0.05），見圖1A。然后采用不同 5-FU（25～150 μmol/L）與40 μmol/L的RES共同處理SW620細胞24 h，發現與單獨5-FU處理組比較，不同濃度5-FU+RES組中SW620細胞活力均明顯降低（P<0.05），見圖1B。另外，SW620細胞克隆檢測表明，單獨RES（40μmol/L）、單獨 5-FU（50 μmol/L）和 RES+5-FU 聯合處理均能明顯減少SW620細胞克隆數（P<0.05），并且RES+5-FU組相比于RES組和5-FU組細胞克隆數也顯著降低（P<0.05），見圖1C、1D。

圖1 RES和5-FU聯合處理對SW620細胞活力和克隆的影響Fig.1 Effects of RES and 5-FU combination on the ability and colonies of SW620 cells

2.2 RES增強5-FU對SW620細胞凋亡的誘導作用 與對照組比較，RES組、5-FU組和RES+5-FU組SW620細胞凋亡率及凋亡相關蛋白Cle-caspase 9、Cle-caspase 7和Cle-PARP表達水平顯著升高（P<0.05）；與RES+5-FU組比較，RES組和5-FU組SW620細胞凋亡率及凋亡相關蛋白Cle-caspase 9、Cle-caspase 7和Cle-PARP表達水平則明顯降低（P<0.05），見圖2。

圖2 RES和5-FU聯合處理對SW620細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of RES and 5-FU combination on the apoptosisof SW620 cells

2.3 RES和5-FU聯合處理對SW620細胞中PI3K/Akt信號通路的影響 與對照組比較，RES組、5-FU組和RES+5-FU組SW620細胞中PI3K亞基p85、110β和PDK1及Akt磷酸化水平顯著降低（P<0.05）；與RES+5-FU組比較，RES組和 5-FU組SW620細胞中p85、110β和PDK1及Akt磷酸化水平則明顯升高（P<0.05），見圖3。

圖3 RES和5-FU聯合處理對PI3K/Akt信號轉導的影響Fig.3 Effects of RES and 5-FU combination on the transduction of PI3K/Akt pathway

2.4 PI3K抑制劑LY294002對SW620細胞生長的影響 與對照組比較，LY294002組、RES+5-FU組和RES+5-FU+LY294002組SW620細胞活力和克隆數明顯降低，而細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；與RES+5-FU組比較，RES+5-FU+LY294002組SW620細胞活力和克隆數明顯降低，而細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），見圖4。

圖4 LY294002處理SW620細胞生長的影響Fig.4 Effects of LY294002 on the growth of SW620 cells

2.5 PI3K過表達對SW620細胞生長的影響 與對照組比較，PI3K mimics組SW620細胞活力和克隆數顯著升高（P<0.05），RES+5-FU組和RES+5-FU+PI3K mimics組SW620細胞活力和克隆數顯著降低，而細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）。與RES+5-FU組比較，RES+5-FU+PI3K mimics組SW620細胞活力和克隆數明顯升高，而細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），見圖5。

圖5 PI3K過表達對SW620細胞生長的影響Fig.5 Effect of PI3K overexpression on the growth of SW620 cells

3 討論

5-FU作為結腸癌臨床化療的一線藥物，有效的提高了總體生存率。然而，5-FU治療也存在嚴重的局限性，如廣泛的腫瘤耐藥和毒性，導致治療效果受到限制，迫切需要提高其化療的效果。

已有研究指出，RES具有抗結腸癌細胞增殖和促凋亡的作用，還可以通過靶向多條信號通路治療胃腸道腫瘤[6]。本項研究主要探討結腸癌SW620細胞對RES和5-FU聯合治療的反應。研究已證實5-FU和RES分別能抑制腫瘤細胞生長[8]，但是聯合作用抗結腸癌的活性尚不清楚。本實驗結果提示，RES和5-FU增強對結腸癌細胞生長的抑制作用是通過同時調節Caspase/PARP和PI3K/Akt信號通路實現的。該研究證實RES增強了人結腸癌細胞對5-FU化療的敏感性，并考察了其聯合作用潛在的分子機制。實驗結果可作為天然化合物輔助治療提高腫瘤化療藥物療效的依據，并支撐RES和5-FU的協同作用。

流式細胞術分析表明，RES和5-FU對SW620細胞毒性的增強作用于誘導細胞凋亡相關。細胞凋亡或細胞程序性死亡是結腸癌發生發展和組織內環境穩定的重要生物學過程[9]。caspase信號途徑的激活是細胞凋亡的基礎，其中細胞色素c從線粒體膜間隙釋放至細胞質中是caspase依賴性凋亡通路的前提。釋放的細胞色素c可與ATP結合，并與pro-caspase 9結合形成凋亡小體，從而切斷caspase 9前體，激活效應因子caspase 3[10]。本研究發現，RES顯著增強5-FU介導的半胱氨酸蛋白酶Cle-caspase 9、Cle-caspase 7和Cle-PARP的激活作用。因此，結果提示5-FU和RES聯合抑制結腸癌細胞增殖與caspase依賴性凋亡通路的激活有關。

PI3K/Akt信號通路與多種腫瘤的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為密切相關，抑制其激活已被證實能阻斷生存信號通路，加速腫瘤細胞的死亡[11-12]。針對PI3K/Akt信號通路及其相關關鍵信號分子的有效靶向作用，有望成為腫瘤治療的重要方式。本實驗發現，RES和5-FU聯合處理可抑制結腸癌細胞中PI3K/Akt信號通路。另外，PI3K抑制劑干預可部分促進RES和5-FU介導的結腸癌細胞凋亡，而PI3K過表達則部分降低對細胞增殖的抑制作用。然而，早期已有相關報道指出RES可通過激活PI3K/Akt信號轉導降低髓核細胞凋亡[13-14]。該結論與本研究結果不一致的主要原因是，PI3K/Akt在不同細胞類型中發揮的生物學效應不同，并且RES可通過不同途徑去調節PI3K/Akt信號活化，進而調節相關的生物學行為。

綜上所述，RES通過增強化療藥物抗腫瘤細胞增殖及促其凋亡活性，協同5-FU抑制結腸癌細胞的生長。此外，實驗發現，RES協同5-FU對結腸癌SW620細胞的抑制作用，可以通過同時靶向caspase/PARP和PI3K/Akt信號通路實現。這些發現為RES協同5-FU治療結腸癌的分子機制提供了新見解，并表明這種組合干預可能成為結腸癌治療的一種更有效方法。