2型糖尿病周圍神經病變患者血清miR-155水平變化及相關研究

朱珠，黃勇

糖尿病周圍神經病變(DPN)是以自發性疼痛、感覺減退為主要特征的糖尿病微血管的常見并發癥，若未及時診治可導致感染、破潰甚至截肢[1-2]，因此DPN的早期診療具有重要的臨床價值。DPN的發病機制目前未明，大量證據[3-4]顯示miRNA的異常表達參與了DPN的起病，并與DPN的病情和轉歸密切相關。最新研究[5]發現，miR-155可降低DPN大鼠坐骨神經的運動和感覺傳導速度，且將其沉默后檢測到坐骨神經損傷明顯緩解，從動物層面提示了miR-155與DPN的可能關聯。然而，miR-155與DPN的臨床研究目前未見報道，其臨床應用仍待評估。基于此，本文以DPN患者為觀察對象，觀察miR-155水平變化，探討其臨床診療價值同時分析其與TNF-α、IL-1β相關性，以期為DPN的早期診療提供更多臨床證據，并進一步揭示疾病的可能機制。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2017年1月至2019年12月在丹陽市人民醫院內分泌科住院的2型糖尿病(T2DM)患者。所有病例的診斷均符合T2DM診斷標準[6]，并根據其是否合并DPN，將其分為T2DM不伴周圍神經病組(NDPN組)和T2DM伴周圍神經病變組(DPN組)，DPN組均符合DPN診斷標準[7]并經EMG檢查證實。入組標準：(1)年齡≥18周歲；(2)1個月內未進行抗炎、營養神經等治療。排除標準：(1)腦卒中、CNS感染、癲癇等；(2)合并有心血管、肝、腎等嚴重原發性疾病，精神病患者；(3)合并有腫瘤、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、貧血者；(4)近2周有發熱、感冒及其他感染性病史。共納入160例T2DM患者，其中NDPN組86例，男54例，女32例；DPN組74例，男45例，女29例；兩組性別構成具有可比性(P>0.05)。本研究通過了丹陽市人民醫院倫理學委員會審查，所有受試者知情同意并均簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-155提取和相對表達測定 所有入組患者于次日清晨留取空腹靜脈血5 ml，不抗凝自然狀態靜置30 min，3 000 r/min離心10 min后留取上清液放置于-20 ℃環境進行保存。所有操作按照miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書要求提取miRNA。根據miR-155引物反轉錄出對應的cDNA，并采用實時熒光定量PCR測定miR-155表達量。PCR反應條件：92 ℃ 15 min，(90 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s)×5個循環，(95 ℃ 20 s，61 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s)×40個循環。所有引物由上海生工生物工程公司合成。以U6為內參，采用2-ΔΔCT法分析miR-155表達數值相對水平情況并記錄數據。

1.2.2 血清生化指標及TNF-α、IL-1β檢測 所有受試者入院后次日清晨抽取患者空腹靜脈血5 ml，不抗凝自然狀態靜置30 min，3 000 r/min離心10 min后留取上清液，使用生化分析儀檢測血清三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖、肌酐、尿素氮同時檢測糖化血紅蛋白并記錄數據。DPN組患者進行血清TNF-α、IL-1β測定，采用 ELISA法并按照試劑盒中說明書的要求檢測并記錄。

1.2.3 多倫多臨床評分系統(TCSS)評估 所有入組的DPN患者行多倫多臨床評分系統(TCSS)評估[8]，總分19分，由兩位經驗豐富的內分泌科醫師執行并記錄。

2 結 果

2.1 NDPN組與DPN組一般資料比較 見表1。與NDPN組相比，DPN組患者年齡、體重指數、空腹血糖、糖化血紅蛋白、糖尿病病程、低密度脂蛋白和TCSS評分均顯著升高(均P<0.05)。兩組間性別、吸煙史、高血壓病史、膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、肌酐和尿素氮水平差異均無統計學意義(均P>0.05)。

表1 NDPN組及DPN組一般資料的比較[x±s,例(%)]一般資料NPDN組(n=86)DPN組(n=74)P值年齡(歲)60.89±8.1364.72±7.270.000性別(男)54(62.79)45(60.81)0.797吸煙史38(44.19)38(51.35)0.366高血壓58(67.44)52(70.27)0.700收縮壓(mmHg)148.76±17.22143.86±14.770.057舒張壓(mmHg)80.67±10.2582.67±12.770.273體重指數(kg/m2)25.01±2.3225.84±2.510.032空腹血糖(mmol/L)6.17±1.216.73±0.970.003糖化血紅蛋白(%)6.97±0.787.23±0.460.012糖尿病病程(年)6.75±5.339.67±7.660.000血脂異常66(76.74)56(75.68)0.871膽固醇(mmol/L) 3.62±0.73 3.77±0.770.208三酰甘油(mmol/L)1.76±0.681.62±0.510.148低密度脂蛋白(mmol/L)2.27±0.692.55±0.580.007高密度脂蛋白(mmol/L)1.19±0.201.22±0.330.481尿素氮(mmol/L)5.66±1.315.87±1.720.382肌酐(μmol/L)74.81±14.3672.68±12.850.252TCSS評分(分)1.54±1.4610.29±2.870.000 注:1 mmHg=0.133 kPa

2.2 NDPN組與DPN組血清miR-155水平比較 NDPN組患者血清miR-155相對表達量(6.48±0.96)明顯低于DPN組(7.52±1.01)，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 DPN組血清miR-155與TCSS量表評分的相關性分析 見圖1。進一步對DPN組血清miR-155與TCSS評分行相關分析顯示，血清miR-155水平與TCSS評分呈正相關(r=0.603,P<0.01)。

圖1 DPN組血清miR-155與TCSS量表評分的相關性分析散點圖

2.4 多因素Logistic 回歸分析 將年齡、體重、空腹血糖、糖化血紅蛋白、糖尿病病程、低密度脂蛋白、TCSS評分和血清miR-155水平納入多因素Logistic回歸分析結果顯示，年齡(X1)、糖化血紅蛋白(X2)、糖尿病病程(X3)、TCSS評分(X4)和血清miR-155(X5)均為DPN危險因素，差異有統計學意義(均P<0.05)(表2)。據此構建的Logistic回歸方程為：Z=1/[1+e-(-6.015+0.492*X1+0.769*X2+0.817*X3+0.665*X4+0.743*X5)]，Hosmer and Lemeshow Test檢驗P=0.086，顯示回歸模型擬合度較好。似然比檢驗χ2=97.143，P<0.001，模型有統計學意義。

表2 DPN的多因素Logistic回歸分析變量βWald χ2值OR值95%CI P值年齡0.49215.3591.6351.307～1.912 0.001糖化血紅蛋白0.76917.6122.1581.924～2.3150.005糖尿病病程0.81712.5692.2642.015～2.4770.003TCSS評分0.6659.0171.9441.692～2.2860.018miR-1550.74312.7552.1021.995～2.2030.009

2.5 血清miR-155診斷DPN的ROC曲線評估 為進一步評估miR-155應用于DPN患者的診斷效能，對血清miR-155進行ROC曲線分析，其曲線下面積0.836，敏感性88.9%，特異性82.5%(圖2)。

圖2 血清miR-155的ROC曲線

而聯合年齡、糖尿病病程、低密度脂蛋白、TCSS評分和血清miR-155構建的ROC曲線曲線下面積0.912，靈敏性95.6%，特異性89.6%(圖3)。

圖3 聯合分析的ROC曲線

2.6 DPN患者血清miR-155和TNF-α、IL-1β的相關性分析 DPN組血清TNF-α檢測值為(95.19±18.77)pg/ml，IL-1β為(19.03±6.29)pg/ml；分別與血清miR-155行相關性分析結果見圖4、圖5。血清miR-155分別與TNF-α、IL-1β呈正相關(r=0.675,r=0.701；均P<0.01)。

圖4 血清miR-155與TNF-α的相關性分析散點圖

圖5 血清miR-155與IL-1β的相關性分析散點圖

3 討 論

DPN的發病機制十分復雜，包含慢性炎癥反應[9]、神經營養紊亂[10]、氧化應激[11]等多重病理生理過程，在多種因素共同作用下導致了DPN的發生。近年來，miRNA與DPN研究成為領域內關注重點。miR-155是miRNA的重要成員，既往研究[12-13]多集中于腫瘤、類風濕關節炎等領域。隨著研究的深入，Khamaneh等[14]發現，糖尿病大鼠腎、心臟、主動脈、和坐骨神經的miR-155表達水平明顯低于正常大鼠，其特征性部位的表達降低提示miR-155可能與糖尿病并發癥的發生存在關聯。Chen等[5]則通過對DPN大鼠研究發現，DPN大鼠miR-155抑制后增加了坐骨神經的運動和感覺傳導速度、增強血管生成并減輕炎癥反應，從動物層面證實了miR-155對坐骨神經存在損傷作用。本研究顯示，DPN患者血清miR-155水平較對照組明顯增高，與動物層面證據一致，提示miR-155的增高與DPN的起病密切相關。而進一步相關性分析顯示，miR-155與TCSS評分呈高度正相關，提示miR-155或可用于DPN患者病情嚴重程度的評估，具有良好的臨床實用價值。

本研究結果顯示，DPN組年齡、體重指數、空腹血糖、糖化血紅蛋白、糖尿病病程、低密度脂蛋白和TCSS評分均較NDPN組顯著升高，與既往向鵬月等[15]報道具有一致性，進一步佐證了DPN起病機制的復雜性。多因素Logistic回歸分析則顯示，年齡、糖化血紅蛋白、糖尿病病程、TCSS評分和血清miR-155五項指標具有統計學意義，且miR-155亦可作為DPN的獨立危險因素。而miR-155的ROC曲線下面積達0.836，具有較高的靈敏性和特異性，提示血清miR-155可作為輔助DPN診斷的良好指標。同時，本文亦將Logistic回歸篩選出的年齡、糖化血紅蛋白、糖尿病病程、TCSS評分資料與血清miR-155聯合納入分析。據此構建的ROC曲線下面積為0.912，靈敏度和特異性均優于miR-155單一評估，顯示miR-155應用于聯合評估時具有更高的效能。而年齡、糖化血紅蛋白、糖尿病病程、TCSS評分等資料在T2DM患者臨床診療工作中易于收集，極大便利了DPN早期診療工作的開展。此外，鑒于DPN炎性損害機制已被廣泛認可[9]，本文亦選取了TNF-α和IL-1β這兩項經典炎性指標以評估miR-155與神經炎性的可能作用關系，而miR-155與二者較優的正相關系數亦高度提示miR-155可能通過影響炎性因子代謝參與了DPN的發生，這需要今后在細胞和動物實驗進一步探討。

綜上所述，本文觀察DPN患者血清miR-155的變化，進而評估其應用于DPN診斷的臨床價值，并對其可能的作用途徑進行初步探討。結果顯示，miR-155具有良好的獨立診斷效能，且在結合年齡、糖化血紅蛋白、糖尿病病程、TCSS評分分析后更具優勢，可為T2DM患者DPN的診斷提供良好分析指標。