藏藥紅景天苷對斑馬魚發育及急性毒性的評價

樊紅艷 何樹梅 楊建偉 劉紅旭

西藏民族大學醫學部生命科學高校重點實驗室,陜西 咸陽 712082

藏藥是民族醫藥的代表之一，在我國傳統醫藥中發揮著重要作用。藏藥紅景天是景天科多年生草本植物，又名“掃羅瑪布爾(藏語)”“薔薇紅景天”等，被人們稱為“高原人參”[1]。紅景天苷(Salidroside，SAL)是由紅景天中提取的一種主要有效成分[1]。近年來，紅景天苷在是一種開發前景較好的藥物，在臨床上得到日益廣泛的應用。在抗衰老方面，紅景天苷通過激活AMPK磷酸化，抑制NF-κBp65和NLRP3炎性小體的活化來改善內皮炎癥和氧化應激反應[2]。據報道[3]：紅景天苷中分離出的一種成分與白藜蘆醇具有相當的抗衰老效果，通過miR22/SIRT1途徑增加線粒體的生物合成，從而延緩衰達到抗衰老的功效。在抗腫瘤方面，紅景天苷一方面通過抑制相關信號通路的激活降低腫瘤細胞的增殖，抑制腫瘤細胞的生長，誘導其發生凋亡，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉移[4-6]；另一方面通過增強巨噬細胞的吞噬功能和T、B淋巴細胞的免疫功能來預防腫瘤的發生和發展[7]。在抗炎癥方面，紅景天苷在各種病理狀態下均具有抗炎活性，較其他抗炎制劑安全性更高、副作用更小[8]。其他方面，紅景天苷還能夠促進大鼠脊髓損傷的功能恢復[9]，通過AKT /GSK3β信號傳導抑制血小板功能和血栓形成，在治療血栓或心血管疾病方面具有重要的作用[10]等。紅景天苷對不同疾病的治療及預后起到了積極的保護作用，因而具有重要的研究價值。

新興的模式生物斑馬魚以其胚胎透明、發育迅速、體積小、成本較低等優勢已被廣泛應用于發育生物學和人類疾病的研究中[11]。斑馬魚的胚胎具有藥物滲透性，可應用于藥物研究及毒性的研究[12]，為評價藥物毒性提供了理想的工具。本研究采用受精后6h(6 hours-post-fertilization,6hpf)斑馬魚胚胎及受精后4d(4 days-post-fertilization,4dpf)幼魚來評價紅景天苷急性毒性效應及對斑馬魚胚胎發育的致畸作用，為確定紅景天苷對斑馬魚疾病模型的安全劑量提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 野生型AB斑馬魚由上海市公共衛生臨床中心斑馬魚實驗室飼養提供。循環養殖水根據實驗室斑馬魚使用指南[13-14]中的方法配置。水溫控制在(28±0.5)℃，PH值7.0～7.2，電導率450～550 μS/cm,光亮/黑暗周期為14 h/10 h。成年斑馬魚每日喂食3次(人工孵育豐年蝦2次，輔助飼料1次)。

1.1.2 實驗試劑 紅景天苷購置于上海詩丹德標準技術服務有限公司。

1.1.3 實驗儀器 斑馬魚飼養系統(上海鱗道)；變倍體視顯微鏡(日本奧林巴斯)；生化培養箱(濟南創日新)；六孔板；移液槍；塑料吸管；50ml離心管；培養皿；交配缸。

1.2 實驗方法

1.2.1 斑馬魚的配種及胚胎的收集 實驗前一晚8點將野生型雌雄斑馬魚按照1∶1或1∶2配對，放入裝有隔板的交配缸中，第二天早上8點給予光照，抽離隔板，雄魚開始追逐雌魚并在30 min內完成交配產卵。產卵完成后，用養殖水輕柔沖洗數次除去未受精卵、糞便等殘留物后收集于盛有養殖水的培養皿中，置于28.5 ℃溫箱中培養待用。

1.2.2 給藥方法 給藥方式為浸泡法，具體實驗方法參照文獻[15]所述以及Patricia McGrath的斑馬魚評價藥物安全和毒性方法[16-17]進行。

1.2.3 紅景天苷樣品溶液的配置 本實驗使用胚胎培養液將母液稀釋至0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM五個濃度梯度。

1.2.4紅景天苷對斑馬魚胚胎致畸試驗方法 在顯微鏡下挑選受精后6 h(6 hour-post-fertilization,6hpf)且發育狀態良好的胚胎，并將其隨機轉入含有不同濃度紅景天苷溶液的6孔板，每板設置5個(0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM)藥物濃度，同時以養殖水作為空白組，每孔40枚胚胎。置于28.5 ℃溫箱中培養，每隔24 h更換紅景天苷樣品溶液1次，以保證溶液中各參數穩定，分別于給藥后12、24、48、72 h觀察并記錄胚胎的形態學變化。其中，畸形的種類主要有卵黃囊腫大、尾部彎曲、魚鰭缺失、心包腫脹。取不同親本的胚胎重復三次試驗。

1.2.5 紅景天苷對斑馬魚胚胎毒性試驗方法 在顯微鏡下挑選受精后6 h(6 hour-post-fertilization,6hpf)且發育正常的胚胎，并將其隨機轉入含有不同濃度紅景天苷溶液的6孔板，每板設置5個(0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM)藥物濃度，同時以養殖水作為空白組，每孔40枚胚胎。置于28.5 ℃溫箱中培養，每隔24 h更換紅景天苷樣品溶液1次，以保證溶液中各參數穩定，分別于給藥后12、24、48、72h觀察并記錄胚胎的死亡變化。取不同親本的胚胎重復三次試驗。

1.2.6 紅景天苷對斑馬魚幼魚毒性實驗方法 在顯微鏡下挑選受精后4 d(4 days-post-fertilization,4dpf)且發育正常的胚胎，并將其隨機轉入含有不同濃度紅景天苷溶液(0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM)的培養皿，同時以養殖水作為空白組，每皿20尾于28.5 ℃恒溫生化培養箱中培養，每隔24 h更換紅景天苷樣品溶液1次，以保證溶液中各參數穩定，分別于給藥后24、48、72 h觀察并統計幼魚的死亡率。取不同親本的幼魚重復三次試驗。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0軟件對數據進行統計處理，采用統t檢驗,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 紅景天苷對斑馬魚胚胎發育的評價 在顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎在不同時間點時不同濃度的紅景天苷溶液中與空白對照組相比，畸形數均≤2，均沒有出現心包水腫、脊柱彎曲、尾部彎曲及溶解畸形等現象。空白對照組與不同濃度的紅景天苷組畸形率比較，無統計學差異(P>0.05)，表明在受試劑量下，紅景天苷對斑馬魚胚胎的發育無明顯的致畸作用(圖1)。

圖1 斑馬魚胚胎暴露于不同濃度紅景天苷溶液及空白對照組不同時期的形態

2.2 紅景天苷對斑馬魚胚胎急性毒性的評價 在顯微鏡下分別觀察12、24、48、72 h斑馬魚胚胎在不同時間點各組的死亡數，不同濃度的紅景天苷組與空白對照組相比，死亡數均≤2，無統計學差異(P>0.05),表明在受試劑量下，紅景天苷對斑馬魚胚胎相對安全，無明顯的急性毒性作用。如圖2所示。

注：與對照組相比，P>0.05。圖2 斑馬魚胚胎暴露于不同濃度紅景天苷溶液及空白對照組不同時期的存活率

2.3 紅景天苷對斑馬魚幼魚急性毒性的評價 將4dpf(4 days-post-fer fertilization,4dpf)的斑馬魚幼魚分別暴露在不同濃度的紅景天苷溶液中，分別在給藥后24、48、72 h觀察幼魚的死亡情況。與空白對照組相比，不同濃度的紅景天苷組幼魚的死亡數均≤2，無統計學差異(P>0.05),不同濃度的紅景天苷對斑馬魚幼魚無明顯的急性毒性作用。如圖3所示。

圖3 斑馬魚幼魚暴露于不同濃度紅景天苷溶液及空白對照組的形態

3 討論

本研究以理想的模式生物斑馬魚為模型，采用浸泡給藥的方式來評價紅景天苷對于斑馬魚胚胎的發育及幼魚的急性毒性作用。結果表明，在濃度為0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM的紅景天苷溶液對斑馬魚胚胎發育無致畸作用，對其胚胎和幼魚無明顯的急性毒性作用，這一結果與大鼠模型中的結果相似[18]，是否更高的劑量濃度能夠對斑馬魚胚胎的發育及幼魚產生致畸作用及毒性作用暫不明確。

紅景天苷作為一種重要的藏藥，具有較高的藥用價值，而利用斑馬魚模型來評價紅景天苷的毒性試驗尚未報道。希望可以通過斑馬魚模型來完善對紅景天苷毒性的認知，以期為紅景天苷在斑馬魚疾病模型的安全用量提供理論依據,同時也能夠為我們后續實驗進展奠定基礎。