紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

楊明爽 邊 雨 曲佳樂 高 陸

吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司，吉林 長春 130012

紅景天是景天科植物紅景天Rhodiolacrenulata(Hook. f. et Thoms. )H. Ohba的干燥根和根莖。主要分布西藏、四川、云南等西部地區(qū)[1]。中國古代第一部醫(yī)學(xué)典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》，將紅景天列為藥中上品。化學(xué)成分主要有酚類、萜類、黃酮類、苷類、木質(zhì)素類等，其中酪醇和紅景天苷被認(rèn)為是紅景天的主要藥理活性成分[2]。紅景天具有很高的藥用價值，具有抗輻射、抗疲勞、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等功效[3-4]。

傳統(tǒng)湯劑存在服用、存儲、攜帶不便等問題。中藥配方顆粒和傳統(tǒng)湯劑相比具有質(zhì)量穩(wěn)定、療效可靠、便于攜帶、服用方便、便于保管等優(yōu)勢[5-7]。依據(jù)國家藥典委員會發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)湯劑技術(shù)要求(征求意見稿)》，將標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為衡量中藥配方顆粒是否與湯劑基本一致的標(biāo)準(zhǔn)參照物，以保障臨床用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性[8-9]。本研究旨在開展紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為配方顆粒后續(xù)生產(chǎn)及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Ultimate3000型高效液相色譜儀(美國Thermo公司)；JY2003電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；JY-8多鍋煎藥機(jī)(山東青州精誠醫(yī)藥設(shè)備制造有限公司)；Scientz-30F冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；SB-1200D 型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)

1.2 藥品與試劑 試劑：甲醇、乙腈為色譜純，來自Fisher公司，其他試劑均為分析純，水為超純水。

對照品：紅景天苷對照品(批號110818-20160705，純度：98.8%)，酪醇對照品(批號 111676-200602)均來自中國食品藥品檢定研究院；

樣品：共收集紅景天飲片十五批，其中西藏7批；新疆4批；甘肅2批;河北2批;包含了紅景天的道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)。

表1 紅景天飲片信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備 按照《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)湯劑技術(shù)要求(征求意見稿)》的技術(shù)要求確定制備方法：取紅景天飲片100 g，加水煎煮2次，第一次加9倍水浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸60 min，用200目濾布過濾，第二次加7倍水煎煮，武火煮沸，文火保持微沸40 min，過濾，合并濾液；采用減壓濃縮方法進(jìn)行低溫濃縮，溫度不超過50 ℃，濃縮至100 mL；將濃縮液置于培養(yǎng)皿，-56 ℃凍存12 h 后冷凍干燥，即得紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑干粉。

2.2 紅景天苷含量測定 參照2015版《中國藥典》[10]紅景天藥材項(xiàng)下紅景天苷含量測定方法中流動相體系，進(jìn)行了供試品溶液制備及相關(guān)方法學(xué)考察，確定檢測方法如下。

2.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水溶液(15∶85)為流動相；檢測波長為275 nm。色譜圖如圖1所示。

圖1 對照品(A)和供試品(B)HPLC圖

2.2.2 對照品溶液的制備 取紅景天苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含紅景天苷0.50 mg的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑干粉約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系的考察 精密稱取紅景天苷對照品4.68 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.4680 mg·mL-1的紅景天苷對照品貯備液。量取六份對照品貯備液各1 mL，分別加入0 、1 、2 、3 、4 、5 mL甲醇，搖勻，配制成濃度分別為0.4680、0.2340、0.1560、0.1170、0.0936、0.0780 mg·mL-1的對照品溶液，精密吸取5 μL，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=21.666x+0.2354，r=0.9993，結(jié)果表明，紅景天苷進(jìn)樣量在0.39 ～2.34 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一批(編號S1)紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑約0.25 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL。按“2.2.1” 項(xiàng)下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果紅景天苷峰面積RSD=0.85%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批(編號S1)紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑干粉約0.25 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL。按“2.2.1” 項(xiàng)下色譜條件測定，測得同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑干粉中紅景天苷的含量均值為1.59 %，RSD =1.29%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批(編號S1)紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑干粉約0.25 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL。按“2.2.1” 項(xiàng)下色譜條件測定，分別在制備后放置0、4、8、12、16、20 h進(jìn)樣檢測，結(jié)果紅景天苷峰面積RSD=1.04%(n=6)，表明供試品溶液在20 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)湯劑干粉(編號S1)，約0.125 g(共6份)，精密稱定，分置25 mL容量瓶中，分別精密加入一定量的紅景天苷對照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”色譜條件進(jìn)行液相分析。結(jié)果，平均回收率為101.41%，RSD為1.54%(n=6)，表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.5 指標(biāo)成分含量測定 按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定十五批標(biāo)準(zhǔn)湯劑中紅景天苷的含量，并計(jì)算紅景天苷轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見表2。

表2 十五批標(biāo)準(zhǔn)湯劑測定結(jié)果

結(jié)果，十五批標(biāo)準(zhǔn)湯劑平均出膏率為24.82%，按照均值加減30%的范圍浮動為17.37%～32.27%；標(biāo)準(zhǔn)湯劑中紅景天苷平均含量為1.81%，按照均值加減30%的范圍浮動為1.26%～2.35%；紅景天苷平均轉(zhuǎn)移率為48.45%，按照均值加減30%的范圍浮動為33.92%～62.99%，本研究的十五批標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、紅景天苷含量及轉(zhuǎn)移率均在此范圍內(nèi)，表明制備工藝規(guī)范，穩(wěn)定、可行。

2.3 指紋圖譜研究

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Aglient C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)為流動相；梯度洗脫，0～20 min，5%～10%乙腈；20～75min，10%～20%乙腈；75～120 min，20%～30%乙腈。檢測波長為275 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為25 ℃。此色譜條件下，各色譜峰的分離度良好，峰形對稱。色譜圖如圖2所示。

峰2(S)：紅景天苷；峰3：酪醇圖2 紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜

2.3.2 混合對照品溶液的制備 取紅景天苷、酪醇對照品適量，加入甲醇制成每1 mL含紅景天苷0.500 mg、酪醇0.686 mg，即得混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 稱取紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑干粉約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，在稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 方法學(xué)考察

2.3.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑干粉約0.25 g，精密稱定，按照“2.3.3”方法制備供試品溶液一份，按“2.3.1”項(xiàng)下連續(xù)進(jìn)樣6次，以紅景天苷(S)為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果RSD分別為0.20%、1.85%(n=6)，均在3 %以內(nèi)，表明儀器精密度良好。

2.3.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑干粉約0.25 g，精密稱定6份，按照“2.3.3”方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，以紅景天苷(S)為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果RSD分別為0.45%、2.01%(n=6)，均在3 %以內(nèi)，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑干粉約0.25 g，精密稱定，按照“2.3.3”方法制備供試品溶液，分別在制備后放置0、4、8、12、16、20 h后，按照“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，以紅景天苷(S)為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果RSD分別為0.23%、1.51%(n=6)，均在3 %以內(nèi)，表明供試品溶液在20 h 穩(wěn)定性良好。

2.3.4.4 指紋圖譜的建立與分析 按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定十五批紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，將所得到的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)軟件》，采用多點(diǎn)校正將譜峰自動匹配，中位數(shù)法計(jì)算得出樣品指紋圖譜的共有模式。紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中呈現(xiàn)11個共有峰，通過與對照品圖譜比較，指認(rèn)峰2紅景天苷、峰3為酪醇，其中以紅景天苷為參照峰(S峰)。十五批次紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜相似度均在0.9以上。色譜圖如圖3所示。

圖3 十五批紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜

3 討論

《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)湯劑技術(shù)要求》強(qiáng)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)湯劑是衡量中藥配方顆粒是否與單味中藥湯劑基本一致的物質(zhì)基準(zhǔn)。本研究共收集十五批紅景天飲片樣品，分別來自4個主產(chǎn)地(西藏、新疆、甘肅、河北)，試驗(yàn)所用樣品具有一定的代表性，并且按照規(guī)范步驟制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，通過監(jiān)測出膏率、指標(biāo)成分含量和轉(zhuǎn)移率指標(biāo)，表明標(biāo)準(zhǔn)湯劑工藝規(guī)范，穩(wěn)定、可行，并為后續(xù)配方顆粒研究及大生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，采用指紋圖譜及紅景天苷含量測定相結(jié)合，從整體定性及指標(biāo)成分定量方向進(jìn)行質(zhì)量控制，其中指紋圖譜是目前控制中藥材綜合分析最有效、最直觀的手段之一，能較全面地獲得重要化學(xué)群的特征信息，可以更加客觀地對中藥及標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行質(zhì)量評價和質(zhì)量控制[11-14]。本研究采用高效液相色譜法，建立紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜。通過色譜條件、供試品制備方法等考察，確定最佳檢測方法，紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜11個共有峰，并指認(rèn)出紅景天苷、酪醇2種成分，十五批標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度均在0.9以上，方法準(zhǔn)確可行。

為紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和臨床用藥提供了依據(jù)和研究思路。