芪斛楂顆粒質量標準提升研究

安 巧 馮 敏 肖正會 萬 科 柳小蘭 王海波 王道平*

1.省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014；3.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550025；4. 葵花藥業集團(貴州)宏奇有限公司，貴州 六盤水 550000

芪斛楂顆粒是葵花藥業集團(貴州)宏奇有限公司的獨家品種，由黃芪、炙甘草、茯苓、石斛、山楂、黨參、陳皮、白術等11味中藥組成。具有健脾和胃、益氣固表、消食導滯的功效，主要用于改善小兒脾胃氣虛、脾失健運癥引起的厭食、偏食、汗多、大便不調、易感冒等癥狀。臨床研究發現，芪斛楂顆粒用于輔助治療小兒急性上呼吸道感染[1]、治療兒童營養不良合并反復呼吸道感染[2]、治療小兒脾虛型腹瀉[3]、治療小兒厭食[4-5]、嬰兒腹瀉[6]，療效顯著。

芪斛楂顆粒各藥材來源產地較廣，質量差異較大。復方中各處方原藥材需要從源頭進行優選和控制來保證芪斛楂顆粒優質有效，因此，在進行質量標準提升研究前需對各原料藥品質進行檢測。目前，芪斛楂顆粒的質量標準中，只對甘草酸銨有含量測定要求，尚未見文獻報道其質量控制的方法。處方中11味原料藥材所含化學成分組成復雜，個別成分的定性定量分析難以充分反映芪斛楂顆粒中所含化學成分的種類與數量。指紋圖譜可較充分的反映出藥物所含各種化學成分量分布的整體狀況，可提高中藥復方質量控制[7-9]，并為制劑藥效物質基礎研究奠定基礎[10]。為更有效的控制制劑質量，確保其臨床用藥的安全、有效，本實驗首次采用高效液相色譜法(HPLC)建立芪斛楂顆粒的指紋圖譜，應用對照品對其主要特征峰進行指認，對復方化學成分指紋圖譜色譜峰的歸屬進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀； KQ-300DA型數控超聲波清洗器；ME104E/02電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；EYELA-N-1100旋轉蒸發器。

1.1.2 實驗試藥 橙皮苷(批號110721-201316)、甘草苷(批號111610-201607)、甘草酸銨(批號110731-201720)、尿囊素(批號111501-200202)、齊墩果酸(批號110709-201808)、熊果酸(批號110742-201823)、白術內酯I(批號111975-201501)、白術內酯II(批號111976-201501)、白術內酯III(批號111978-201501)、黨參炔苷(批號111732-201607)、黃芪甲苷(批號110781-201717)，以上標準物質均購買自中國食品藥品檢定研究院。茯苓酸(批號PCS-181120)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號PCS-190417)、石斛酚(批號PCS-190616)，購自成都植標化純。兒茶素(批號161209)由Chengdu Purechem-Standard Co.，Ltd.提供。

黃芪、山藥、炙甘草、茯苓、石斛、炒麥芽、山楂、木瓜、黨參、陳皮、白術，均由葵花藥業集團(貴州)宏奇有限公司提供；芪斛楂顆粒(樣品批號：20190101、20190102、20190311、20190905、20190906、20190907、20190908、20190909、20190910、20190911)，均由葵花藥業集團(貴州)宏奇有限公司生產；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)，超純水(由純水/超純水-一體機制備)，乙腈(色譜純，默克股份兩合公司)，其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 11味處方原藥材有效含量參照文獻[11-17]進行

1.2.2 色譜條件 色譜柱為CAPCELL PAK C18 4.6 mm×250 mm，5μm)；乙腈-水(A∶B)梯度洗脫：0～30 min，10%～40% A，30～50 min，40%～90%；50～60 min，90% A；流速1.0 mL·min-1，檢測波長230 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.2.3 制備對照品 取甘草苷、橙皮苷對照品適量，精密稱定，以色譜甲醇為溶劑，分別制成含甘草苷、橙皮苷約0.1 mg·mL-1溶液。

1.2.4 制備供試品 取芪斛楂顆粒約5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量。搖勻，過濾，取續濾液25 mL，濃縮至干，用甲醇定容至5 mL容量瓶中，搖勻后用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，即得。

1.2.5 單味藥及陰性供試品溶液的制備 稱取黃芪、葛根、陳皮及缺各單味藥材復方陰性藥材，按照各味藥的處方配比與處方工藝提取制備，并按照1.2.3項下方法制備。

2 結果

2.1 11味中藥材有效含量測定及品質評價 11味處方原料藥材不同批次經過檢測，結果如下：“陳皮20190603，陳皮20190601”中橙皮苷含量較高；“甘草JP-20180709，炙甘草20190101”中甘草苷、甘草酸含量較高；“茯苓JP-20180705，茯苓JP-20180706”中茯苓酸含量較高；“山藥JP-20190501，山藥JP-20190503”中尿囊素含量較高；“木瓜JP-20180803，木瓜飲片20190101”中齊墩果酸和熊果酸含量較高；“白術JP-20180801，白術(偏小)”中白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ和白術內酯Ⅲ的總量較高；“黨參20190601，黨參飲片20190101”中黨參炔苷的含量較高；“黃芪JP-20180704，黃芪JP-20180707”中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷含量較高；“山楂JP-20180701，山楂JP-20180803”中枸櫞酸含量較高；“麥芽20190502，麥芽20190503”中兒茶素含量較高；“流蘇石斛JP-20180701，流蘇石斛JP-20180702”中石斛酚含量較高。如圖1所示。

圖1 11味中藥材不同批次含量測定

由此可見，每味藥材不同批次樣品中有效成分的含量存在顯著差異。

2.2 指紋圖譜方法學考察

2.2.1 重復性試驗 取芪斛楂顆粒(批號：20190311)，按1.2.4項下方法，平行制備供試品溶液5份，按1.2.2項下色譜條件，記錄色譜圖。以橙皮苷的色譜峰為參照峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果表明，16個共有峰，相對保留時間RSD均低于0.4 %，相對峰面積RSD均低于5.0 %。

2.2.2 穩定性試驗 取芪斛楂顆粒(批號：20190311)，按1.2.4項下方法制備供試品溶液，按1.2.2項下色譜條件，分別在0 h、2.5 h、5 h、10 h、15 h、20 h、25 h、30 h、48 h進樣測定，記錄色譜圖。以橙皮苷的色譜峰為參照峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果表明，16個共有峰的相對保留時間RSD均小于0.5 %，相對峰面積RSD均低于5.0 %，供試品溶液在48 h內基本穩定。

2.2.3 精密度試驗 取芪斛楂顆粒(批號：20190311)，按1.2.4項下方法制備供試品溶液，按1.2.2項下色譜條件，連續進樣6次，記錄色譜圖。以橙皮苷的色譜峰為參照峰(S)，計算16個共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果表明，16個共有峰，相對保留時間RSD均小于0.6 %，相對峰面積RSD均低于3.0 %。

2.3 芪斛楂顆粒液相指紋圖譜建立及特征峰標定

2.3.1 芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜的建立及評價 取10批芪斛楂顆粒樣品，按1.2.4項下方法制備供試品溶液，按1.2.2項下色譜條件，依次進樣測定，記錄樣品色譜圖。

將10批芪斛楂顆粒的HPLC圖譜以AIA格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版)軟件，采用S1號樣品(批號20190311)的指紋圖譜作為參照圖譜，時間窗寬度為0.50，中位數法，經多點校正自動匹配后生成芪斛楂顆粒共有模式對照指紋圖譜；確認了16個共有峰。10批芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜疊加圖及對照指紋圖譜如圖2所示。

A．10批樣品疊加圖譜； B．共有模式對照圖譜圖2 芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜

以共有模式對照指紋圖譜作為參照圖進行了相似度計算，10批芪斛楂顆粒樣品與共有模式對照指紋圖譜的相似度在0.985 ～ 0.999，各批樣品的相似度較好。結果見表1。

表1 10批供試品與對照指紋圖譜的相似度

2.3.2 芪斛楂顆粒復方與藥材指紋圖譜色譜峰相關性分析 按1.2.4項下方法制備芪斛楂供試品溶液、藥材對照溶液、芪斛楂顆粒陰性對照溶液，按1.2.2項下色譜條件，記錄色譜圖。利用色譜峰保留時間考察相關性，對芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜的16個峰歸屬進行分析。

16個共有峰歸屬到各藥材，其中14號峰來源于白術；2號、6號、14號峰來源于陳皮；4號、5號、7號、15號、16號峰來源于甘草；11號峰來源于黃芪；12號、13號峰來源于流蘇石斛。

2.3.3 采用對照品法對芪斛楂顆粒指紋圖譜各個色譜峰的指認 根據芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜共有峰和各味藥材色譜峰的歸屬分析，有針對性的配制了甘草苷、橙皮苷對照品溶液，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。通過與對照品對比共指認了2個色譜峰，確認5號峰為甘草苷(如圖3所示)，6號峰為橙皮苷(如圖4所示)。

圖3 芪斛楂顆粒、甘草及甘草苷的圖譜

圖4 芪斛楂顆粒、陳皮及橙皮苷的圖譜

在共有峰中，6號峰是芪斛楂顆粒中的主要活性成分之一，理化性質穩定，基線分離度好，故選為參照峰。

3 討論

3.1 提取溶劑的考察 本實驗對提取溶劑進行篩選，分別用70 %乙醇、95 %乙醇、70 %甲醇、甲醇提取樣品，結果采用70 %甲醇、甲醇提取所得的色譜峰均較好，為簡便實驗操作及方便溶劑回收利用，選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2 提取方法的選擇 本實驗對提取方法進行考察，分別采用超聲提取和回流提取樣品，結果表明，超聲提取和回流提取的結果無顯著差異，為實驗操作簡便，選擇超聲提取；本實驗對樣品進行超聲30 min、超聲60 min提取，結果表明，使用甲醇超聲30 min和甲醇超聲60 min所得色譜峰一致，為了節約時間，選擇甲醇超聲30 min作為提取條件。

3.3 流動相的選擇 由于本樣品中成分復雜，故采用梯度洗脫的方式，先后嘗試甲醇-水、乙腈-水流動相系統，并且嘗試了多種不確定的梯度條件，經過對各種色譜圖的比較，最后確定乙腈-水為流動相，采用梯度洗脫，分離度理想，特征峰明顯。

3.4 檢測波長的選擇 取供試品溶液進樣，采用二極管陣列檢測器進行全波長掃描，并對各波長下的色譜圖進行分析比較，芪斛楂顆粒大部分成分在230 nm有較大吸收，因此選擇230 nm作為指紋圖譜檢測波長。

3.5 共有峰的歸屬 比較復方與處方原料藥材的色譜圖發現，處方藥材對共有峰的貢獻為白術(14號峰)、陳皮(2號、6號、14號峰)、甘草(4號、5號、7號、15號、16號峰)、黃芪(11號峰)、流蘇石斛(12號、13號峰)。所歸屬的色譜峰都能與藥材和復方對應，有良好的相關性。14號峰的貢獻來源于白術和陳皮。雖然有與茯苓對照藥材相對應的色譜峰(16號峰)，但在茯苓陰性樣品的指紋圖譜中也有該色譜峰，說明16號峰不是茯苓專屬，僅與茯苓有關；雖然有與山楂對照藥材相對應的色譜峰(1號、2號峰)，但在山楂陰性樣品的指紋圖譜中也有該色譜峰，說明這兩個色譜峰不是山楂專屬，僅與山楂有關；未見與黨參、麥芽、木瓜、山藥有關的色譜峰，可能由于復方在煎煮過程中，成分之間相互發生作用導致成分轉化或損失；其中3號、8號、9號、10號峰不能得到歸屬，可能是在制劑制備過程中11味藥材共煎而產生的。綜上所述，復方與處方藥材的成分存在差異，兩者之間并非簡單的加和關系。本實驗對復方成分的來源歸屬作了初步研究，為闡明芪斛楂顆粒的藥效物質基礎提供了依據。

本研究通過精密度試驗、穩定性試驗和重復性試驗對芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜方法進行了方法學考察，建立了芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜，共標定16個共有峰，指認了其中2個色譜峰。采用所建立的方法對10批芪斛楂顆粒樣品進行了指紋圖譜測定，采用相似度分析方法對樣品進行分析，結果顯示，本研究建立的芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜方法穩定、可靠、重現性好，可為葵花藥業芪斛楂顆粒的質量標準提升提供依據。