加工與貯藏條件對偃松種鱗精油抑菌活性和功能穩定性的影響1)

禚宇 孫文婕 李德海 蔣沙沙 祝清超

(東北林業大學，哈爾濱，150040) (內蒙古森工集團阿龍山森工公司苗圃)

偃松(Pinuspumila)是松科(Pinaceae Spreng. ex F. Rudolphi)松屬(PinusLinn)常綠灌木，又名馬尾松、五針松及日本石松，廣泛分布在中國東北、俄羅斯遠東、日本和朝鮮半島[1]。偃松種子、芽、枝條、針葉、根部等，在東北亞民間藥物中被用于治療神經痛、皮膚病、風濕病、黃癬、關節炎、肺結核等疾病[2]。偃松的果實可食用，含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸、多酚等生物活性物質[3]，是健身、健腦、滋補的良品[4]。偃松種鱗作為松仁的加工副產物，資源豐富，而且含有大量的揮發性精油，具有抑菌、抗氧化功能。但是，偃松種鱗精油易揮發、不穩定，導致加工利用率較低，不僅浪費生物資源，而且嚴重污染環境。

植物精油作為一種天然活性物質，具有良好的抗氧化、抑菌活性，已被廣泛應用于醫藥保健、食品添加劑、化妝品等領域[5]。然而，由于精油的易揮發性、物理化學性質不穩定、熱降解等缺點，使其在加工貯藏過程中容易受到環境因素的影響，從而降低生物活性[6]。溫度、光照對精油香氣成分含量和組分含量均存在不同程度影響，芳樟醇對溫度、光照敏感度較低，在高溫時，含量會有小幅度下降[7]；香茅醇、酯類、金合歡醇、烷烴類含量，在常溫時變化趨勢不明顯，在高溫時變化較大[8]。pH值低的環境，會使精油中酚類化合物所帶的羥基的電離度下降，疏水性增加，更容易和細菌細胞膜結合，提高抑菌活性[9]。水分含量高、貯藏溫度高、光照的條件時，精油更容易酸敗，造成精油質量下降，從而對香味成分的穩定性、貯藏性造成不良影響；采用密封、避光、低溫的條件，更加有利于精油香味成分的貯藏，使其發揮更好的功效[10-11]。但是，目前關于加工與貯藏條件對偃松種鱗精油抑菌功能穩定性的研究較少。

本研究以偃松種鱗為試驗材料，采用鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取精油；以大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)4種常見腐敗菌為供試菌，以抑菌圈直徑、最低抑菌濃度、最低殺菌濃度為評價指標，分析熱、酸堿性、光照、金屬離子和殼聚糖等處理條件對偃松種鱗精油抑菌活性和功能穩定性的影響。旨在為探索偃松種鱗精油的最佳加工和貯藏條件，避免精油在此過程的損失提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

偃松種鱗，于2020年11月份采自內蒙古阿龍山林業局，將其晾干后用高速萬能粉碎機粉碎，過60目篩(孔徑0.3 mm)，密封儲存備用；NaCl、CaCl2、FeCl3、FeCl2、KCl，固體，購自天津市大茂化學試劑廠；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉，均采購于北京奧博星生物技術有限責任公司；二甲基亞砜(DMSO)，購自南通潤豐石油化工有限公司；殼聚糖，購自國藥集團化學試劑有限公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)，供試菌種均來源于東北林業大學實驗室。

主要儀器：Clevenger 精油提取裝置(蒸餾瓶3 L，訂制)；DS—T100 型高速多功能粉碎機(上海市頂帥工貿有限公司)；LT502E 型電子天平(常熟市天量儀器有限責任公司)；EL20 型實驗室pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業有限公司)；電熱恒溫培養箱(天津市塞得利實驗分析儀器制造廠)。

1.2 偃松種鱗精油的提取

采用鹽析輔助水蒸氣蒸餾法[12]提取精油。稱取偃松種鱗粉末200 g，置于3 000 mL的圓底燒瓶中，按m(種鱗)∶V(蒸餾水)為1 g∶8 mL的比例加入1 600 mL蒸餾水，同時加入8 g NaCl2，攪拌均勻后浸泡3 h。預處理完成后，連接Clevenger裝置進行水蒸氣蒸餾8 h；待裝置冷卻后，將得到的精油用無水硫酸鈉干燥后，溶于滅菌后的二甲基亞砜溶液(體積分數為5%)中配制成體積分數為50%的精油溶液，4 ℃密封避光保存備用。

1.3 加工貯存條件

溫度設計：將體積分數為50%的精油溶液，在4 ℃分別放置0、1、2、3、6、9、12、15 d；另取一定量的精油，在25、60、80 ℃，分別處理0、30、60、90、120、150、180 min。

pH設計：將體積分數為50%的精油溶液，分別用質量分數為2%的NaOH溶液、質量分數為50%的檸檬酸溶液，調節pH值為3、4、5、6、7、8、9、10；同時將無菌水調至不同pH值作為對照組。

紫外線照射設計：將體積分數為50%的精油溶液放置在紫外燈下(功率20 W，垂直距離35 cm)，分別照射30、60、90、120、150 min；對照組不進行處理。

金屬離子溶液配制：用體積分數為5%的二甲基亞砜溶液，分別配制質量濃度為25 g/L的CaCl2、KCl、FeCl3、FeCl2溶液；取2.5 mL精油、一定量的上述離子溶液均置于5 mL容量瓶中，用體積分數為5%的二甲基亞砜溶液定容，使得CaCl2、KCl、FeCl3、FeCl2溶液的最終質量濃度均為5、10、15、20、25 g/L；以同質量濃度不含偃松種鱗精油的CaCl2、KCl、FeCl3、FeCl2溶液為對照組。

殼聚糖溶液配制：取適量殼聚糖溶于體積分數為1%的醋酸溶液，用體積分數為5%的二甲基亞砜溶液定容后，配制成質量濃度為25 g/L的殼聚糖溶液；取2.5 mL精油、一定量的上述殼聚糖溶液均置于5 mL容量瓶中，用體積分數為5%的二甲基亞砜溶液定容，使得殼聚糖溶液的最終質量濃度為5、10、15、20、25 g/L；以同質量濃度不含偃松種鱗精油的殼聚糖溶液為對照組。

1.4 精油抑菌活性測定

菌懸液的制備：取出-80 ℃甘油凍藏的不同菌種，解凍后，將其接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，進行復蘇。將復蘇后的菌種接種到斜面培養基上，進行2～3次活化后，從斜面培養基上挑取1環菌體接種到液體培養基中，放入恒溫震蕩培養箱中，37 ℃培養至菌體的對數生長期后，采用平板計數法將菌懸液濃度調至106～107個/mL。

偃松種鱗精油抑菌圈直徑測定：采用濾紙片法[13]對偃松種鱗精油的抑菌活性進行測定。無菌環境中，用移液槍取100 μL菌懸液置于含有固體培養基的培養皿上，涂布均勻后制成含菌平板，每個平板均勻放置3片直徑為6 mm的濾紙片(濾紙片均已滅菌)。每片濾紙上滴加10 μL體積分數為50%的偃松種鱗精油溶液，用體積分數為5%的二甲基亞砜溶液作為對照。將培養皿用封口膜密封后，倒放在恒溫培養箱中，37 ℃培養24 h后測量抑菌圈直徑。

最低抑菌體積分數、最低殺菌體積分數的測定：采用倍比稀釋法[14]，測定偃松種鱗精油對4種供試菌的最低抑菌體積分數、最低殺菌體積分數。取10支試管(編號1～10)——1號試管中，加入5 mL液體培養基，為空白；9號試管中，加入4 mL液體培養基、1 mL體積分數為5%的二甲基亞砜溶液、100 μL菌懸液；10號試管中，加入5 mL培養基與100 μL菌懸液，為陰性對照；2～8號試管中，加入100 μL菌懸液，再依次加入1 mL由體積分數為5%的二甲基亞砜溶液稀釋的不同體積分數的偃松種鱗精油溶液(0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 mL/L，再加入4 mL液體培養基。將10支試管置于37 ℃培養24 h。培養結束后，分別取這4種菌懸液100 μL于固體培養基中進行涂布，放入恒溫培養箱中37 ℃培養24 h，觀察4種菌的生長情況。以無細菌生長的平板所對應的精油體積分數，為精油對該細菌的最低抑菌體積分數。

將上述平板繼續培養24 h，觀察細菌生長情況。以無細菌生長的平板所對應的精油體積分數，為精油對該細菌的最低殺菌體積分數。

1.5 數據處理

試驗數據以“平均值±標準差”表示，所有數據利用Excel 2019、SPSS 21.0、Origin 8.0統計，進行數據方差顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 偃松種鱗精油的抑菌活性

精油抑菌圈直徑：通過測量抑菌圈直徑的大小，定性評價偃松種鱗精油對不同菌種的抑菌活性(見圖1)。由表1可見：偃松種鱗精油對4種供試菌均有一定的抑菌效果，其抑菌活性，由大到小依次為大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌。對大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌效果，好于對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌效果。革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌在細胞結構上存在差異；革蘭氏陰性菌的細胞壁比較薄，交聯松散，使得精油中的活性物質更容易經過細胞壁，破壞細菌細胞膜的通透性，并進一步影響細菌內部結構；因此，偃松種鱗精油對革蘭氏陰性菌的抑菌活性，高于對革蘭氏陽性菌的抑菌效果。

圖1 偃松種鱗精油對4種供試菌的抑菌圈直徑

表1 偃松種鱗精油對不同菌種的抑菌活性

最低抑菌體積分數(MIC)、最低殺菌體積分數(MBC)：通過最低抑菌體積分數、最低殺菌體積分數對4種供試菌的抑菌效果進行定量分析表明(見表2)，不同的菌種對精油的敏感程度不同，最低抑菌體積分數、最低殺菌體積分數也不同。偃松種鱗精油，對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌4種供試菌的最低抑菌體積分數，分別為5.000、10.000、20.000、20.000 mL/L；對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌4種供試菌的最低殺菌體積分數，分別為10.000、20.000、40.000、40.000 mL/L。由此可見，少量的偃松種鱗精油便可抑制細菌的生長，實際應用成本比較低。

表2 偃松種鱗精油對4種供試菌的抑菌效果

2.2 溫度對精油抑菌活性的影響

由表3可見：在4 ℃貯藏精油，隨時間的增加4種供試菌的抑菌圈直徑基本無變化。因此，認為精油在4 ℃可以長期存放，且穩定性較好。由表4可見：25 ℃時，隨時間的增加抑菌圈直徑基本不變，精油的抑菌活性穩定；在60、80 ℃時，隨著處理時間的延長，精油對4種供試菌的抑菌圈直徑明顯降低，因此，可以認為精油的貯藏溫度越高其抑菌的效果越差。這表明，精油中所包含的抑菌物質，在高溫條件時揮發或者失去活性，從而影響了精油對細菌的抑制作用。因此，在精油的加工、應用過程中，應將溫度控制在室溫條件下，以避免高溫導致精油的抑菌活性降低。

表3 4 ℃時不同處理時間的精油抑菌穩定性

2.3 pH對精油抑菌活性的影響

由表5可見：精油對大腸桿菌的抑菌圈直徑，從pH=3的(14.25±0.14)mm逐漸降低到pH=10的(10.85±0.13)mm；精油對其他菌種的抑菌圈直徑，也隨著pH的增大逐漸降低；可以看出，隨著pH的增大，偃松種鱗精油的抑菌活性逐漸降低。借鑒文獻[15]并結合本研究結果，認為造成這一現象的原因主要是，細菌在酸性環境中自身的活性降低，使得精油可以更好地抑制其生長；其次，pH的降低，會減小精油活性成分上所帶有的羥基的電離度，疏水性增加，使精油與細菌菌體的細胞膜及其脂蛋白的結合變得更加容易，進一步提高了抑菌活性。

表4 25、60、80 ℃時不同處理時間的精油抑菌穩定性

表5 不同pH時的精油抑菌穩定性

2.4 紫外照射對精油抑菌活性的影響

由表6可見：隨著紫外線照射時間的不斷延長，偃松種鱗精油對4種不同供試菌的抑菌效果基本沒有變化，保持了良好的穩定性；該結果與艾薇等[16]研究一致。主要是因為，精油中所含的成分多為醇類、烯萜類物質，這些物質都對紫外線有較好的穩定性，在紫外線照射時不會發生結構上的改變，因此精油在紫外線的照射下抑菌活性保持穩定。

2.5 金屬離子對精油抑菌穩定性的影響

由表7可見：金屬離子Ca2+、Fe3+、Fe2+、K+對4種供試菌均有一定的抑菌效果，但抑菌效果不顯著。由表8可見：添加不同的金屬離子溶液后，精油對4種供試菌的抑菌圈直徑，隨著金屬離子質量濃度的增大而增大，抑菌效果明顯增強。借鑒文獻[17]并結合本研究結果，認為金屬離子靠近細菌細胞時，會破壞細菌細胞膜，從而使細菌失去繁殖能力，導致死亡；當金屬離子與精油結合使用時，金屬離子破壞細胞膜，使得精油更容易與細菌結合，加速細菌細胞凋亡，提升了精油的抑菌效果。

表6 紫外線照射時間不同時的精油抑菌穩定性

2.6 殼聚糖對精油抑菌活性的影響

由表9可見：殼聚糖本身具有一定的抑菌活性，且隨著殼聚糖質量濃度的增大，活性增強。加入殼聚糖后，偃松種鱗精油溶液對4種供試菌的抑菌圈直徑明顯增大。目前，殼聚糖多是采用制備復合膜以及微膠囊與精油結合，以提高精油的穩定性和抑菌活性，使其更好地應用在果蔬及肉制品保鮮中[18-19]；本研究結果表明，當殼聚糖與偃松種鱗精油結合使用時，抑菌效果會得到提升，這也為精油的進一步應用提供了技術支撐。

表7 金屬離子對4種供試菌的抑菌效果

表8 添加不同質量濃度金屬離子的精油抑菌效果

表9 殼聚糖及其對精油的抑菌效果

3 結論

偃松種鱗精油對4種供試菌的生長，均有一定的抑制作用，其抑菌活性，由大到小依次為大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌；由于革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌細胞結構和組成成分不同，導致其對革蘭氏陰性菌的抑制作用大于對革蘭氏陽性菌的作用。

抑菌穩定性的研究結果表明，偃松種鱗精油對紫外線有較強的穩定性。

在酸性環境中，偃松種鱗精油的抑菌活性提高；而在堿性環境中，精油的抑菌效果下降。

在4、25 ℃時，偃松種鱗精油有較好的抑菌穩定性；而在60、80 ℃時，偃松種鱗精油抑菌活性會隨著時間的延長而下降。殼聚糖、金屬離子的添加，都會使偃松種鱗精油的抑菌效果有所提升。本研究為偃松種鱗精油的貯藏加工與應用提供了技術參考，有利于偃松種鱗精油的進一步開發與利用。