不同水力條件下海水人工濕地凈化效果及其影響分析

賈 軍 ,崔正國,唐小雙,張可可 ,崔鴻武 ,李曉嬌1, ,曲克明

(1 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海海洋大學國家海洋生物科學國際聯合研究中心，上海 201306；2 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室，山東省漁業資源與生態環境重點實驗室，中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島海洋科學與技術試點國家實驗室,海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266071)

中國是海水養殖大國，2019年海水養殖總產量為2 065.33萬t，產值3 500余億元[1]。海水養殖在帶動沿海地區社會經濟發展、增加漁民收入、提高人民生活水平和優化飲食結構等方面發揮了重大作用[2]。另一方面，中國海水養殖仍存在一些粗放的養殖方式，養殖尾水的任意排放給局部近岸海洋環境帶來嚴峻挑戰。因而，在生態文明和綠色新發展理念背景下，實現養殖尾水達標排放已成為水產養殖可持續發展和產業升級的必然要求。

目前，循環水處理[3]、電化學[4]、絮凝[2]等已逐漸應用于海水養殖尾水的處理。循環水處理系統自動化程度高,運行穩定,便于維護,節水節能,能夠準確測量和控制水質環境因子,將養殖環境控制在最佳狀態,適合大規模和高密度水產養殖，但是循環水處理設備的陳舊、老化可能產生微生物黏泥現象，影響循環水處理的質量；電化學技術是一種綠色環保發展前景廣闊的水處理技術，整體工藝簡單，反應裝置簡單易操作，反應條件溫和，但電化學需要大量電極材料，而電極材料比較昂貴，經濟成本高，而且單獨使用電化學時無法達到預期效果；生物絮凝是解決海洋水產養殖(特別是循環水養殖)所面臨的氮素污染、養殖環境制約和部分養殖方式飼料成本較高等問題的有效技術，主要適用于濾食性養殖對象，飼料的多級利用可以實現飼料成本的降低，但是碳源的成本、天氣狀況的影響都會給生產增加很多不穩定性。人工濕地是一種綜合的水處理技術，利用物理、化學和生物等手段實現對氮、磷、化學需氧量(COD)等污染物的去除，因其凈化高效、成本低廉和綠色環保等優點，已被應用于處理生活污水、工業廢水和暴雨徑流等不同類型水體，并取得良好去除效果[5]。目前，人工濕地技術對黃顙魚[6]、青魚、草魚[7]、鱖魚[8]、翹嘴紅鲌[9]等淡水養殖尾水處理已顯示出良好的應用前景。由于海水的鹽度效應，將人工濕地用于處理海水養殖尾水的研究較少[10]，王艷艷等[11]利用復合垂直流蘆葦人工濕地處理大菱鲆養殖尾水，發現間歇進水方式影響著人工濕地脫氮效率,調節間歇進水時間可作為調控系統脫氮效率的一種手段；吳俊澤等[12]利用復合垂直流人工濕地處理牙鲆養殖尾水外排水，發現DIN的去除效果比DON好，表層基質脲酶活性與TN和硝酸鹽的去除存在相關趨勢，脫氫酶活性影響著尾水中氨氮的去除。水力負荷、水力停留時間是影響人工濕地凈化效果的關鍵水力因素。不同類型或不同處理工藝的人工濕地對污水中的污染物凈化效果不同[13-14]。

本研究結合文獻資料并通過預試驗設置3種不同水力負荷及水力停留時間，利用復合垂直流人工濕地探討牙鲆養殖尾水氮、磷、COD等主要污染物的凈化效果及其影響因素；并利用高通量測序的方法，分析了人工濕地微生物群落結構與脫氮作用的關系，以期為海水養殖尾水人工濕地處理技術的應用提供參考，并為強化海水養殖尾水中氮的去除提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 系統構建

人工濕地尾水處理系統由牙鲆(Paralichthysolivaceous)養殖池、沉淀池、復合垂直流人工濕地系統以及儲水池等組成(圖1)。

圖1 牙鲆養殖尾水人工濕地處理系統示意圖Fig.1 Schematic diagram of constructed wetland system for P.olivaceus culture wastewater treatment

養殖池為圓柱體聚丙烯材質，直徑0.6 m、高0.8 m，有效容積0.13 m3；人工濕地長0.8 m、寬0.6 m、高0.8 m，有效容積0.3 m3。人工濕地通過隔板均分為下行流池和上行流池兩部分，底部相通。由下往上依次填入礫石35 cm(粒徑5～15 cm)、煤渣20 cm(粒徑3～10 cm)、粗砂10 cm(粒徑1～5 mm)，種植互花米草(SpartinaalternifloraLoisel)，密度為60株/m2。系統一側外置采樣管，可實時采集各基質層水樣，設置采樣點7個，其中1、2、3分別為下行流池中進水層、粗砂層、煤渣層采樣點；4為礫石層底部采樣點；5、6、7分別為上行流池煤渣層、粗砂層和出水層采樣點。

1.2 系統運行及水力條件控制

2019年8—10月，在山東省海陽市某水產有限公司開展養殖尾水處理試驗。養殖池位于養殖車間內，人工濕地處理系統置于室外。系統各單元通過水管連接，養殖尾水自養殖池排出后，經沉淀池過濾后由泵提升至人工濕地處理系統，依次經下行流池、上行流池凈化后自流進入儲水池。處理后的尾水排放或回流至沉淀池進行循環處理，試驗裝置及流程如圖1所示。每日喂食牙鲆早、晚各1次，首次投喂2 h后開始試驗。試驗初期先試運行，進行人工濕地系統微生物培養，定期監測進、出水水質指標，1個月后微生物群落基本形成，出水水質趨于穩定，開始水力條件對凈化效果影響試驗。參照實驗室人工濕地前期運行參數，控制水力負荷(HLR)和水力停留時間(HRT)。首先在20 m/d水力負荷狀態下，設置3組不同的水力停留時間：1.5 h、3.0 h、4.5 h。水力停留時間的長短按照循環次數進行控制，3組停留時間分別循環運行0次、1次、2次。每天定時測定水質變化，根據第5天處理效果穩定后的水質計算污染物去除率，3組停留時間下試驗周期為15 d。按照水力負荷由低到高的順序，分別在3組停留時間下運行系統，并取樣分析，試驗總時長45 d。試驗期間記錄天氣變化，避免因雨水進入對處理系統造成干擾。試驗運行期間系統內水質pH為7.53～8.57、溶氧(DO)0.93～5.80 mg/L、溫度20.3 ℃～24.1 ℃、鹽度范圍31.54～33.63。

1.3 采樣與測定方法

利用對角線五點取樣法[16-17]分別采集植物根部和不同基質層樣品，然后將植物根部和各層基質樣品分別混勻，并置于無菌袋中，在4 ℃下保存運輸到實驗室，將植物根部置于無菌管中，加入10 mL 0.1M磷酸鉀緩沖液(pH=8.0)，震蕩洗滌，該步驟重復兩次。將洗滌后的根部取出，放入裝有磷酸鹽緩沖液的小瓶中，超聲波洗滌10 min(參數：160 W，30 s/30 s)。將3次洗滌液混合后用離心機離心收集沉淀(10 000 g離心10 min)，所有樣品放于-80 ℃冰箱保存待測。

1.4 高通量測序分析方法

先用CTAB法[18]提取樣品DNA，利用超微量分光光度計測定DNA的質量濃度和純度，并在5 V/cm的電壓下使用1%質量濃度的瓊脂糖凝膠電泳對DNA的質量濃度和質量進行檢驗。

細菌的16S rRNA基因擴增的上引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG -3′)，下引物為806R(5′-GGCTACHVGGGTWTCCTAAT -3′)，PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環27次；最后72 ℃延伸7 min，終止溫度10 ℃。每個樣本重復3次。

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit純化，Tris-HCL洗脫，2%的瓊脂糖電泳進行檢測。利用QuantiFluorTM-ST(Promega公司)進行檢測定量。根據Illumina MiSeq平臺標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE2*300的文庫。利用Miseq PE300平臺進行測序。

1.5 數據分析

α-多樣性指數(Chao指數、Shannon指數、Simpson指數、Coverage指數)可用Mothur 1.30.1軟件分析得出[19-20]。Chao指數是用Chao1算法估計微生物群落中含OTU 數目的指數，常用來估計物種總數[21]；Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低；Shannon指數值越大，說明群落多樣性越高[22]。

2 結果

2.1 無機氮的去除效果

不同形態DIN在不同水力負荷、停留時間條件下的凈化效果見圖2。

圖2 不同水力條件不同形態DIN質量濃度沿程變化Fig.2 Concentration variations of and DIN under different hydraulic conditions

DIN在不同水力條件的凈化效果見圖2b。沿著水流方向DIN質量濃度總體呈下降趨勢。在水力負荷20 m/d條件下，當HRT為1.5 h時，去除率最低為(52.48±1.44)%；當HRT為4.5 h時，去除率為(95.90±0.53)%；水力負荷在40 m/d條件下，3個HRT條件下，進水DIN質量濃度2.71～4.08 mg/L，出水質量濃度0.22～1.72 mg/L，去除率分別為(47.29±1.50)%、(57.92±2.18)%和(93.85±2.36)%。

圖3 不同水力條件質量濃度沿程變化Fig.3 Concentration variations of under different hydraulic conditions

2.3 COD的去除效果

COD在不同水力負荷條件的凈化效果見圖4。

圖4 不同水力條件COD質量濃度沿程變化Fig.4 Concentration variations of COD under different hydraulic conditions

由圖4可知，沿著水流方向COD質量濃度總體呈下降趨勢。水力負荷在20 m/d條件下，當HRT為4.5 h時，COD進水質量濃度(2.52±0.11)mg/L，去除率最高為(45.59±6.36)%。水力負荷在40 m/d條件下，在HRT為1.5 h、3.0 h、4.5 h時，出水質量濃度分別為(0.05±0.03)mg/L、(0.14±0.05 )mg/L、(0.01±0.01)mg/L，去除率分別為(36.25±4.95)%、(29.49±5.43)%和(38.95±4.14)%。水力負荷在100 m/d條件下，COD的去除效率明顯降低，波動變化較大，3種HRT條件下的去除率分別為(28.23±3.92)%、(26.52±3.38)%和(34.06±0.66)%。

總體而言，下行池的平均去除效率為(48.12±11.46)%，要遠高于上行池的(34.56±5.90)%。當水力負荷為20 m/d、HRT為4.5 h時，COD的去除效果最好。

2.4 微生物群落結構

本次試驗共測序出934 000條高質量序列，經97%相似性聚類后產生5 089個OTUs。微生物測序中物種覆蓋度(Coverage指數)均大于0.98，測序結果表明采集方式設置合理，測序深度覆蓋樣品中大部分物種。系統運行45 d后，人工濕地系統不同基質層和植物根系的α-多樣性指數見表1。

由表1可知，下行池植物根系的菌群豐度高于粗砂層和煤渣層菌群豐度，高于粗砂層38.03%，高于煤渣層9.89%；上行池植物根系微生物的物種豐度略低于粗砂層和煤渣層微生物的物種豐度，下行池植物根系菌群豐度高于上行池7.85%。下行池中，各基質層Chao指數隨著深度的變大呈現逐層升高的趨勢，其中粗砂層為2 329.61±311.09，渣層為2 926.03±324.49，碎石層為3 220.31±365.59，粗砂層物種豐度最低，碎石層物種豐度最高，而上行池呈現相反的趨勢，Chao指數隨著深度的變大呈現逐層降低的趨勢，粗砂層物種豐度最高，為3 043.48±329.13，碎石層物種豐度最低，為2 754.89±273.46，粗砂層物種豐度高于碎石層10.48%。

下行池中植物根系微生物Shannon指數高于各基質層微生物Shannon指數，高于煤渣層17.03%，高于粗砂層10.19%，高于碎石層2.64%；各基質層中碎石層微生物多樣性最好，Shannon指數為5.69，粗砂層次之，Shannon指數為5.30，煤渣層最差，Shannon指數僅為4.99，Shannon指數跟基質層填料結構和水流狀態有關，下行池的碎石層更有利于微生物的附著。上行池中，粗砂層微生物Shannon指數最高，群落多樣性最高，高于煤渣層3.95%，高于碎石層8.43%，植物根系微生物群落多樣性僅高于碎石層0.56%。上行池粗砂層和煤渣層微生物物種豐度、群落多樣性均比下行池粗砂層和煤渣層高，上行池碎石層微生物物種豐度、群落多樣性比下行池碎石層低。

養殖尾水中的氮是難以達標排放的主要污染物。通過對植物根系、基質層樣品微生物功能的鑒別分析，篩選出具有脫氮功能的菌群。如表2所示，其中P1為下行池植物根系樣品，S(1～3)為下行池基質樣品；P2為上行植物根系樣品，S(4～6)為上行池基質樣品。

在復合垂直流人工濕地中微生物的脫氮方式主要有氨氧化、亞硝酸鹽氧化、反硝化。在微生物菌群中，具有氨氧化功能的是亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)兩類菌屬。具有亞硝酸鹽氧化功能的是硝化螺旋菌屬(Nitrospira)，進行反硝化反應的菌群主要是芽孢桿菌屬(Bacillus)、銅綠假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)三類菌群。本次試驗共發現15個菌屬，12個反硝化菌屬，2個氨氧化菌屬和1個亞硝酸鹽氧化菌屬，其中豐度最高的是芽孢桿菌屬(Bacillus)，占比0.97%，銅綠假單胞菌屬(Pseudomonas)次之，豐度0.02%，本試驗人工濕地中脫氮菌群以具反硝化功能的菌群為主。

3 討論

3.1 水力負荷的影響

無機氮去除率隨著水力負荷的增加而降低，低水力負荷條件下，可以滿足人工濕地內各種脫氮反應順利進行所需的時間，各種脫氮反應得以高效進行，水力負荷增大，脫氮效率降低，超過某個水力負荷條件后呈現迅速降低的趨勢，高水力負荷條件下，尾水污染物沉淀和接觸時間下降,植物根系吸附水體中微小顆粒效率降低[23]，不利于植物對營養物質的吸收,也不利于硝化反應和反硝化反應的完全進行。水力負荷在20 m/d條件下，進水DIN質量濃度1.93～3.25 mg/L，HRT為3.0 h和4.5 h時出水質量濃度小于0.5 mg/L，符合SC/T 9103—2007《海水養殖水排放要求》[24]一級標準。

隨著水力負荷升高，出水COD質量濃度亦隨之升高，去除率降低。當水力負荷較低時，尾水可以更好地與人工濕地接觸，微生物的降解作用和生物膜的吸附作用比較充分，但是容易形成厭氧狀態，COD去除效果不佳；增加水力負荷，水流速度變快，人工濕地內部溶氧增加，COD去除效果隨之增強；隨著水力負荷的進一步變大，大量的有機物還沒有跟微生物群落充分接觸就被帶出人工濕地系統，從而影響COD的去除效果，導致COD去除率降低。本系統牙鲆養殖尾水經人工濕地處理前，僅初沉淀后COD的最高質量濃度5.75±0.09 mg/L，已符合一級標準排放要求。COD的去除主要是基質吸附與微生物降解的過程,因而有利于吸附和生化反應過程的運行條件，將有利于COD的去除率的提高。

3.2 停留時間的影響

水力停留時間較短的兩個試驗組中，COD質量濃度較高，特別是在上行池的上升趨勢比較明顯，COD去除率較低，延長HRT，去除率有明顯改善。HRT明顯縮短，導致與附連在基質的生物膜接觸時間變短，有機物還未來得及被降解或吸附就被帶出系統，污染物遷移轉化進行的不夠徹底，導致COD去除率下降。過長的HRT使系統更容易產生厭氧狀態且受基質吸附飽和的影響，導致COD去除率有所較低，因此實際應用中需注意COD去除效果的HRT轉折點。本系統牙鲆養殖尾水經人工濕地處理前，初沉淀后COD的最高質量濃度5.75±0.09 mg/L，已符合一級標準排放要求。

3.3 微生物的影響

下行池獨特的布水方式使溶氧更充足，尾水最先進入下行池，植物根系能攔截大部分顆粒性懸浮物，下行池植物根系更適宜微生物的生長，因水流走向，上行池植物根系位于系統末端，此處的尾水營養物質量濃度不如下行池，微生物物種豐度和多樣性不如下行池。下行池和上行池植物根部最遠深扎煤渣層，兩個流池煤渣層溶氧環境相近，微生物環境相近，Chao指數大小相近。上行池底部溶氧較少，處于缺氧環境，堿度也在此累積，不利于微生物的生長，上行池碎石層微生物菌群豐度比下行池略低，菌群多樣性也比下行池低。

下行池中，植物根系樣品中測得的具有脫氮功能的總共3 318條序列，高于基質中測得的2 691條，植物根系聚集的脫氮功能菌群均比各層基質多。植物根系徑向泌氧(ROL)是構造根際氧化-還原異質微生態系統的核心要素[36]，植物根系深扎基質層，形成各個深度的氧擴散層，形成氧化態的微環境，為各類好氧、厭氧微生物提供良好的生長條件，是人工濕地中有機物、氮磷營養鹽吸收轉化最劇烈的部分[37]。與唐小雙[38]的研究結果一致，具有亞硝酸鹽氧化代謝、反硝化代謝功能的菌屬聚集在植物根系，而氨氧化代謝的功能菌群則更多地分布在各基質層中，主要是因為氨氧化細菌屬更適應于偏堿性環境中[39]。從pH數據可以看出，基質層中下層的pH更高，反硝化反應發生后的pH環境適宜氨氧化細菌的生長。

上行池中，植物根系測得具有脫氮功能的序列共有2 126條，而在基質中共測得3 290條序列，與下行池中脫氮功能菌群的分布情況剛好相反。尾水進入下行池先接觸基質層，再流經植物根系，因此大部分異養厭氧細菌會聚集在基質層，對COD、氮磷營養鹽進行吸收轉化。當尾水流經植物根系時，營養物質質量濃度降低，影響植物根系微生物的生長活動。從代謝功能來看，具有氨氧化代謝、反硝化代謝功能的菌屬聚集在基質層，亞硝酸鹽氧化代謝的功能菌群更多地分布在植物根系。復合垂直流人工濕地系統底部處于缺氧狀態，pH達到峰值，屬于堿性環境，因而上行池底部不適合反硝化功能菌群生長，氨氧化功能細菌適宜pH范圍比反硝化功能細菌大，能夠較為良好地適應；亞硝酸鹽氧化功能菌群傾向于分布在植物根系。

下行池與上行池脫氮功能菌群的分布情況由復合垂直流人工濕地pH環境、植物根系深度和水流方向等因素共同決定。

3.4 pH的影響

低水力負荷有利于人工濕地系統pH的穩定和脫氮效率的提高。不同水力負荷條件下，pH變化趨勢相近，水力負荷狀態對pH的改變影響較小，進入下行池后pH迅速升高，在下行池保持上升趨勢，且高水力負荷條件下pH波動比低水力負荷條件略大，在碎石層達到最高值，除水力負荷為40 m/d、HRT為3.0 h外，進入上行池后均保持緩慢的變化趨勢，但從不同水力負荷pH曲線變化可以看出，低水力負荷在人工濕地系統后段能保持pH平穩的下降，高水力負荷條件則會引起pH的上升。

停留時間會影響出水pH變化，進而影響人工濕地系統的脫氮效率。水力負荷在20 m/d條件下，HRT為1.5 h和3.0 h時，pH在通過煤渣層后又開始上升，或者維持很小的下降趨勢，表明短時間處理下尾水中還有許多未被反硝化反應處理掉的氮營養鹽，使得上行池存在的脫氮功能細菌仍舊能夠進行氮營養鹽的吸收轉化，上行池中氮營養鹽與COD的質量濃度變化可以驗證。微生物活動產生的堿度補充了被消耗的部分，但由于營養物質不夠，所以并沒有出現pH峰值。而HRT為4.5 h時，尾水中大部分營養物質得以被消耗，進入上行池后，堿度得不到補充，反而被大量消耗，所以pH維持著下降的趨勢。停留時間會影響出水pH變化。張歡歡等[40]發現，人工濕地溫度和進水有機負荷對堿度有顯著性影響，有待深入研究。

4 結論

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