外源水楊酸對(duì)水稻苗期生長(zhǎng)與防衛(wèi)相關(guān)基因表達(dá)的影響

劉 寒，戴遠(yuǎn)興，呂明芳，袁正杰，李 靜，嚴(yán)成其，張恒木，*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310021)

自然界中植物常受到多種病原菌的侵害，在與病原菌的長(zhǎng)期斗爭(zhēng)過程中，植物進(jìn)化出了獨(dú)特的免疫系統(tǒng)。一方面，植物通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識(shí)別病原模式分子(pathogen-or micro-derived molecular patterns，PAMP或MAMP)，激發(fā)PAMP免疫(PAMP-triggered immunity，PTI)反應(yīng)，啟動(dòng)抗性相關(guān)基因表達(dá)，阻止病原菌侵染；另一方面，病原體通過釋放效應(yīng)子(effector)減弱植物PTI反應(yīng)，植物R蛋白識(shí)別效應(yīng)子，啟動(dòng)免疫反應(yīng)(effector-triggered immunity，ETI)[1-2]，激活防御信號(hào)，使信號(hào)從病原感染部位傳導(dǎo)至未感染部位，產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)。水楊酸(salicylic acid，SA)是PTI和ETI過程中激活SAR的重要信號(hào)分子，大量研究發(fā)現(xiàn)，外源SA處理能提高植物抵抗生物和非生物逆境脅迫[3-4]。

植物體內(nèi)SA存在2種生物合成途徑：一是異分支酸(ICS)途徑，為擬南芥合成SA的主要途徑；二是苯丙氨酸(PAL)途徑，為水稻合成SA的主要途徑[5-6]。健康擬南芥和本氏煙中SA含量均較低，每g鮮重中通常含0.03～1.00 μg SA[7-13]。擬南芥和本氏煙對(duì)外源SA敏感，0.1～1.0 mmol·L-1外源SA即可穩(wěn)定誘導(dǎo)其防衛(wèi)基因的表達(dá)，增強(qiáng)其對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒等病原菌的抗性[14-17]。單子葉模式植物水稻SA含量較高，每g鮮重通常含SA 8～37 μg[18-19]，推測(cè)水稻對(duì)外源SA的敏感性可能與雙子葉植物不同。不同學(xué)者曾采用0.01～400 mmol·L-1外源SA處理水稻[20-25]，但由于濃度跨度大，測(cè)試的基因不一致，難以總結(jié)出SA對(duì)水稻的生物效應(yīng)，給SA的生產(chǎn)應(yīng)用造成困擾。水稻苗期是水稻生長(zhǎng)發(fā)育過程中對(duì)許多病原體和非生物逆境脅迫的敏感期，在此發(fā)育階段誘導(dǎo)抗性對(duì)水稻穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。SA是誘導(dǎo)植物抗性的重要信號(hào)分子，然而，其處理水稻苗的最適濃度及其對(duì)水稻苗期生長(zhǎng)、防衛(wèi)相關(guān)基因表達(dá)的影響還不清楚。為了分析外源SA對(duì)水稻苗期生長(zhǎng)和防衛(wèi)相關(guān)基因表達(dá)的影響，本研究通過梯度濃度SA處理苗期水稻，并采用分光光度計(jì)、qRT-PCR等方法分析了水稻苗期生長(zhǎng)、抗性相關(guān)基因表達(dá)水平與外源SA濃度的關(guān)系，為SA應(yīng)用和深入研究功能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究使用的水稻品種均為日本晴(Nipponbare)，由本實(shí)驗(yàn)室繁種保存。水楊酸(SA，貨號(hào)為69-72-7)、丙酮等生化試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Trizol購(gòu)于上海Thermo Fisher Scientific公司；反轉(zhuǎn)錄與定量試劑盒購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 水稻栽培與SA處理

將日本晴水稻種子經(jīng)75%乙醇和2%次氯酸鈉除菌后[26]，置于浸潤(rùn)的濾紙上，37 ℃催芽48 h后用水稻全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液[27]培養(yǎng)，于28 ℃、12 h/12 h(L/D)條件下培養(yǎng)；期間每2 d換1次新鮮的水稻營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)2周，達(dá)2葉1心或3葉1心期(多種病原敏感期)后，利用帶有刻度的噴壺分別加入梯度濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol·L-1SA，充分噴施水稻苗期植株(每株2.0 mL)，對(duì)照為1.6%乙醇。由于SA處理能快速誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)，因此本研究采集SA處理0、2、4、8、12、24、48 h樣品，樣品保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA提取和定量分析

采用Trizol試劑，參照項(xiàng)聰英等[28]的方法提取水稻樣品總RNA；采用Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(上海翊圣生物科技有限公司)試劑合成cDNA，方法參照試劑盒說明書；采用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus)(上海翊圣生物科技有限公司)試劑在熒光定量PCR儀7900HT(Thermo Fisher)上進(jìn)行定量分析，反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，定量基因引物信息見表1。

表1 qPCR采用的引物

1.4 水稻葉綠素含量分析

取新鮮水稻苗葉片0.5 g，加入2.0 mL抽提液(乙醇、丙酮、H2O體積比為4.5∶4.5∶1.0)進(jìn)行抽提，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。以抽提液為空白對(duì)照，使用多功能酶標(biāo)儀Spect-raMax?M5(美國(guó)Molecular Devices公司)在波長(zhǎng)645 nm和663 nm處測(cè)定葉綠素提取物吸光度，然后參照修正后的Arnon法公式計(jì)算葉綠素含量[30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源SA處理對(duì)水稻苗期生長(zhǎng)的影響

葉綠素含量是反映水稻苗生長(zhǎng)狀況的重要參數(shù)之一，采用分光光度計(jì)分析SA對(duì)水稻苗葉綠素含量的影響，結(jié)果如圖1-A所示。低濃度SA(≤2.0 mmol·L-1)處理，不影響水稻葉綠素含量，其中，1.0～2.0 mmol·L-1SA處理的水稻苗葉綠素含量在一定時(shí)間內(nèi)略微上升；中濃度SA(4.0 mmol·L-1)處理后，水稻苗葉綠素含量在24 h后開始下降，在48 h后下降顯著(P<0.05)；而高濃度SA(>4.0 mmol·L-1)處理24 h后水稻苗葉綠素顯著(P<0.05)下降。進(jìn)一步觀察表型發(fā)現(xiàn)，高濃度SA(>4.0 mmol·L-1)處理對(duì)水稻生長(zhǎng)影響較大，8.0、16.0 mmol·L-1SA處理24 h后水稻莖桿外周的葉鞘開始褪綠(圖1-B)；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，褪綠區(qū)域逐漸擴(kuò)大(圖1-C)；處理72 h后，褪綠區(qū)域嚴(yán)重黃(白)化，葉片出現(xiàn)萎蔫(圖1-D)；處理72 h后，4.0 mmol·L-1SA處理的水稻苗莖桿外周葉鞘也出現(xiàn)褪綠。表明高濃度SA處理可能通過抑制苗期葉綠素積累影響水稻苗生長(zhǎng)。

2.2 外源SA處理對(duì)SA自身合成的影響

植物體內(nèi)SA存在ICS (isochorismate synthase)和PAL (phenylalanine ammonia lyase)合成途徑，在水稻中PAL途徑占主導(dǎo)地位[31-32]。為了探究外源SA處理對(duì)水稻中SA合成的影響，選取水稻PAL途徑的關(guān)鍵基因OsPAL1進(jìn)行定量分析。結(jié)果(圖2)顯示，低濃度SA(0.1～4.0 mmol·L-1)處理，OsPAL1基因在8 h內(nèi)表達(dá)量顯著下調(diào)(約50%)，12 h后其表達(dá)量呈逐步恢復(fù)趨勢(shì)，與對(duì)照相比，其表達(dá)量恢復(fù)至80%以上，表明低濃度SA處理對(duì)OsPAL1表達(dá)影響較小。高濃度SA(尤其是8.0～16.0 mmol·L-1)處理水稻后，OsPAL1基因表達(dá)顯著下調(diào)(80%～90%)。上述結(jié)果表明，外源噴施SA可下調(diào)OsPAL1基因表達(dá)，其下調(diào)幅度與外源SA濃度呈正相關(guān)，推測(cè)高濃度外源SA可能抑制水稻內(nèi)源SA的生物合成。

2.3 外源SA對(duì)水稻SA受體基因表達(dá)的影響

NPR類基因編碼SA受體蛋白，其中，NPR1是關(guān)鍵基因[33-34]。因此，定量分析NPR1基因的表達(dá)量來研究外源SA對(duì)水稻SA受體基因表達(dá)的影響。結(jié)果(圖3)顯示，外源SA處理后水稻NPR1基因表達(dá)顯著上調(diào)，在處理24 h時(shí)NPR1基因表達(dá)量達(dá)到最高，提升10～20倍，其中，2.0 mmol·L-1SA處理水稻苗24 h后，NPR1表達(dá)量最高。

2.4 外源SA對(duì)水稻W(wǎng)RKY基因表達(dá)的影響

WRKY類轉(zhuǎn)錄因子與SA誘導(dǎo)的抗性密切相關(guān)，SA顯著誘導(dǎo)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的表達(dá)，調(diào)控SA信號(hào)途徑下游基因的表達(dá)[35-37]。本研究選取OsWRKY45、OsWRKY76來分析SA對(duì)水稻苗WRKY基因表達(dá)的影響，結(jié)果見圖4。其中，OsWRKY45對(duì)SA處理的響應(yīng)較慢，在處理早期(2 h)其表達(dá)量幾乎不受影響；當(dāng)SA濃度低于1.0 mmol·L-1時(shí)，在12 h內(nèi)，OsWRKY45表達(dá)量變化的幅度較小；處理24～48 h時(shí)，OsWRKY45表達(dá)量顯著上升，其中1.0～4.0 mmol·L-1SA處理的OsWRKY45表達(dá)量較高，與對(duì)照相比上調(diào)8倍以上。SA濃度超過1.0 mmol·L-1時(shí)，OsWRKY76的響應(yīng)較快，與對(duì)照相比，在2 h之內(nèi)上調(diào)2倍以上；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，OsWRKY76的表達(dá)量穩(wěn)步上升，在24～48 h，OsWRKY76的表達(dá)量最高達(dá)4倍以上(圖4-B)。

2.5 外源SA對(duì)病程相關(guān)蛋白基因的影響

病程相關(guān)蛋白基因(PR基因)是一類重要的防衛(wèi)基因，且參與MAPK調(diào)節(jié)植物穩(wěn)態(tài)的過程，大量的研究表明，SA可影響PR基因的表達(dá)[38-40]。由圖5可知，0.1～16.0 mmol·L-1SA處理的水稻苗中OsPR1a表達(dá)量均上調(diào)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，OsPR1a表達(dá)量也逐漸升高，處理24 h達(dá)到最高。其中，1.0～2.0 mmol·L-1SA對(duì)OsPR1a的誘導(dǎo)效應(yīng)最大；OsPR1b變化趨勢(shì)與OsPR1a不同，低濃度(尤其是0.1 mmol·L-1)SA使OsPR1b的表達(dá)上調(diào)，而較高濃度SA(>1.0 mmol·L-1)處理時(shí)則顯著抑制OsPR1b的表達(dá)。

3 討論

SA可通過調(diào)節(jié)植物基因表達(dá)水平參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、抵抗逆境脅迫[41]。本研究選取的6個(gè)基因均屬于SA生物合成或其抗性信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因，結(jié)果均表明外源SA能影響這些基因的表達(dá)，影響效果與外源SA濃度密切相關(guān)，反映了外源SA濃度的重要性。在擬南芥和本氏煙等雙子葉模式植物中通常采用的外源SA濃度為0.1～1.0 mmol·L-1[13-14]；在水稻中，不同學(xué)者采用外源SA濃度差異較大[20-22，24-25，35，37]，這給處理效果的比較與實(shí)驗(yàn)重復(fù)造成諸多不便。SA在水中的溶解度較低，難以用水溶液配制高于16.0 mmol·L-1的SA，若要配制更高濃度的SA需加有機(jī)溶劑(如乙醇)，而過多的有機(jī)溶劑會(huì)給植物造成新的逆境脅迫[42]；因此，本研究未采用16～400 mmol·L-1SA處理，采用0.1～16.0 mmol·L-1SA。2.0 mmol·L-1SA不僅能顯著誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)通路(NPR1、WRKY45、WRKY76、PR1a)基因的表達(dá)，且對(duì)葉綠素含量、SA合成產(chǎn)生的影響較小，這為后續(xù)外源SA處理提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。8.0 mmol·L-1以上SA能夠顯著誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)通路基因(NPR1、WRKY45、WRKY76、PR1a)的表達(dá)，但明顯抑制水稻苗期葉綠素的積累，處理24 h后甚至可觀察到葉片褪綠、黃化、萎蔫等癥狀；但Xie等[25]采用400 mmol·L-1處理水稻，卻未見其報(bào)道如此高濃度的SA對(duì)水稻生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，其原因尚有待進(jìn)一步探究。有研究顯示，高濃度SA降低小麥、擬南芥葉綠素含量，低濃度SA促進(jìn)葉綠素積累[6]。與此相似，本研究中1.0～2.0 mmol·L-1SA處理48 h，水稻苗葉綠素含量升高，高濃度SA(>4.0 mmol·L-1)處理，會(huì)抑制葉綠素的合成。綜合分析顯示，2.0 mmol·L-1外源SA處理苗期水稻較為合適，在實(shí)際使用時(shí)可根據(jù)其內(nèi)源SA含量適當(dāng)調(diào)整外源SA濃度，避免盲目使用造成人力物力浪費(fèi)。