一株牛源致病性卡氏變形桿菌的分離鑒定與敏感藥物篩選

馬志宇，黃方園，王 巍，易 軍，左之才，*

(1.四川農業大學 動物醫學院/動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014； 2.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066)

卡氏變形桿菌(Proteuscibarius)是一種兼性厭氧、周生鞭毛的革蘭氏陰性機會致病菌，屬于腸桿菌科變形桿菌屬。目前已發現變形桿菌屬15個種，廣泛存在于污水、土壤、糞便等自然環境，以及人和動物的消化道中[1-3]，是機體正常菌群的重要組成部分。在正常情況下，變形桿菌一般不引起人和動物發病，但當正常寄居部位發生改變或機體抵抗力下降時，可在體內大量生長繁殖，引起肺炎、尿道炎、腎盂腎炎等病癥[4-6]；其中，以奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)和普通變形桿菌(Proteusvulgaris)最為常見。有報道稱奇異變形桿菌是造成牛患病的主要病原之一，可使肉牛發生腸炎、肝炎、關節腫脹等病癥[7-9]。陳星等[10]研究表明，普通變形桿菌可能是引起奶牛子宮內膜炎的重要原因。目前有關變形桿菌屬其他菌種引起牛感染的報道仍較少。

卡氏變形桿菌是2016年Hyun等[11]在發酵海鮮中分離到的1株與食品污染有關的新型菌株。目前，大多數研究主要針對卡氏變形桿菌的多重耐藥基因和對污染水源中重金屬銻的吸附作用[12-13]，認為其不具有致病性。最近，Adesina等[14]報道，卡氏變形桿菌能感染人類，導致糖尿病患者創口復發感染。2019年7月，本研究首次從患有發熱、咳嗽、流鼻液等呼吸系統癥狀的病牛鼻腔拭子分離到對小鼠有強致病性的卡氏變形桿菌，該菌可能為引起肉牛感染發病甚至死亡的主要致病菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

2019年7月，四川省宜賓市某牛場10余頭肉牛陸續出現以體溫升高、流涎、流鼻液、呼吸困難為主的呼吸道疾病，且有牛只死亡。無菌采集發病肉牛的鼻腔拭子，立即貯存在放有冰袋的保溫箱中，帶回實驗室進行處理。

1.1.2 試驗動物

12只(雌雄各半)4～5周齡、體重18～20 g的SPF級昆明小鼠購于成都達碩實驗動物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離純化與群集運動特性測定

通過接種環劃線將鼻腔拭子樣品接種于胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar，TSA)培養基上，在恒溫箱中37 ℃倒置培養24 h后，觀察菌落生長形態，選取單個優勢菌落進行純培養。將已純化菌株接種到營養肉湯中37 ℃振蕩培養18 h后，分別接種于瓊脂濃度為1%、2%、3%的固體培養基中央，培養24 h后觀察菌落生長遷徙情況與群集運動。純化后的細菌加入無菌甘油，于-70 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 生化特性鑒定

選取木糖、甘露醇、水楊素、丙二酸鹽、賴氨酸脫羧酶、明膠等細菌生化微量反應管，參照生化管使用說明書和《常見細菌系統鑒定手冊》[15]進行試驗。

1.2.3 16S rRNA基因序列測定與系統發育分析

將純化后的菌株接種于營養肉湯中，37 ℃培養24 h，用16S rRNA基因通用引物(上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；72 ℃ 7 min；12 ℃保存。經瓊脂糖凝膠電泳初步檢測后，將PCR擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。采用Blast與Genbank已公布的10株變形桿菌(表1)的16S rRNA基因序列進行同源性分析，并構建系統進化樹。

表1 GenBank公布的參考菌株信息

1.2.4 小鼠致病性試驗與病理組織學觀察

用接種環蘸取1環已純化甘油保種的菌液接種于胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth，TSB)培養基中，37 ℃ 200 r·min-1恒溫搖床培養12 h，隨后用紫外分光光度計(Thermo公司)在600 nm波長下測定吸光度(D值)，通過換算得出培養后的菌液濃度為7.35×107CFU·mL-1。隨機選取8只SPF級昆明小鼠腹腔注射0.2 mL菌液，另取4只小鼠腹腔注射等量0.9% NaCl溶液作為對照，雌雄各半。每2 h觀察1次，記錄小鼠臨床癥狀表現與死亡情況，及時對死亡小鼠進行剖檢，觀察各組織器官病變情況，并檢測各器官細菌定植情況。無菌采集死亡小鼠的各臟器組織作切片觀察病理學變化。

1.2.5 藥敏試驗

采用紙片擴散法(K-B瓊脂法)對該分離菌進行耐藥表型檢測，將37 ℃恒溫過夜培養的菌液濃度調整為0.5麥氏濁度，取100 μL菌液均勻涂布在MH瓊脂培養基上，經過一段時間被完全吸收后分區域貼上藥敏紙片，于37 ℃恒溫培養24 h，測量抑菌圈直徑，重復3次，取平均值。依據CLSI 2019標準對試驗操作與結果進行判讀。

2 結果與分析

2.1 菌株形態與生長特性

從樣品中分離的優勢菌株ZZC-JM-1在TSA培養基上純化培養24 h后，形成邊緣整齊、表面光滑、不透明的圓形菌落，且霧狀薄膜布滿整個培養基(圖1-a)。挑取單個菌落染色鏡檢，細菌呈革蘭氏陰性、單個或成對的短桿狀(圖1-b)。菌液接種在不同濃度瓊脂培養基中央培養24 h，生長情況有明顯差異，在1%和2%瓊脂培養基上菌斑四周遷徙形成不規則的圓形霧狀薄膜(圖2-a和圖2-b)，前者在相同時間內遷徙速度更快，范圍更廣；在3%瓊脂培養基上則不表現群集運動(圖2-c)。

2.2 生化鑒定結果

分離菌株ZZC-JM-1的葡萄糖、枸櫞酸鹽、木糖、丙二酸鹽、蔗糖、苯丙氨酸、硫化氫、麥芽糖、明膠生化試驗結果呈陽性，乳糖、甘露醇、吲哚試驗結果呈陰性。除麥芽糖和蔗糖試驗呈陽性外，其余生化結果與Adesina等[14]報道的卡氏變形桿菌一致(表2)。

表2 分離菌株ZZC-JM-1生化試驗結果

2.3 16S rRNA序列鑒定與系統進化分析

凝膠電泳結果表明，擴增的菌液16S rRNA基因片段為1 500 bp(圖3)。Blast分析結果表明，該菌株的16S rRNA基因與變形桿菌屬細菌的16S rRNA基因同源性均高于98%，其中，與卡氏變形桿菌的同源性最高，達99.7%。系統進化樹(圖4)顯示，分離菌株ZZC-JM-1的16S rRNA序列與來源于豬糞便的中國江蘇株卡氏變形桿菌(CP047349.1)聚為一個分支，與奇異變形桿菌、普通變形桿菌和同屬其他變形桿菌的遺傳距離較遠。

2.4 分離菌株ZZC-JM-1對小鼠的致病性

2.4.1 攻菌小鼠臨床癥狀與剖檢病變

8只小鼠攻菌后，2 h后開始出現被毛粗亂，眼角出現分泌物，5 h開始萎靡、寒顫，7～14 h攻毒的8只小鼠全部死亡；而對照組4只小鼠運動、飲食未見異常，經過一段時間全部存活。剖檢可見攻菌組小鼠肺充血、呈鮮紅色，肝腫大呈土黃色、表面有出血點，脾淤血腫大(圖5)，心、腎、腦未見明顯病變；而剖檢對照組小鼠器官和腦未出現異常。取攻菌小鼠的心、肺、肝、脾、腎，用無菌接種環劃線接種于普通瓊脂平板上，37 ℃培養12 h后觀察到心、肺、肝、脾、腎中均分離到與上述攻毒菌株菌落形態、生長特性相同的細菌，表明所分離細菌為致病性細菌，可導致小鼠多組織器官發生病變。

2.4.2 病理組織學觀察

病理切片觀察(蘇木精—伊紅染色法，400×)發現，攻菌小鼠肺充血，肺泡壁增厚并呈現以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤(圖6-a)；肝中央靜脈和肝竇淤血，肝索增寬，肝竇變窄，肝細胞變性壞死(圖6-b)；脾淤血，髓質內出現大量紅細胞，并有空泡變性(圖6-c)。

2.5 藥敏試驗

在測定的20種常用抗生素中，分離菌株ZZC-JM-1對頭孢類、青霉素類、碳青霉烯類、四環素類等17種抗菌藥物耐藥，僅對環丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星高度敏感(表3)。

表3 分離菌株ZZC-JM-1藥敏試驗結果

3 結論與討論

變形桿菌可感染動物并造成嚴重的經濟損失。近幾年來，以奇異變形桿菌和普通變形桿菌為主感染羊、鵝、豬等常見畜禽的報道比較多，主要以引起關節炎、肺炎、敗血癥等癥狀為主[16-18]。同時，也可以引起水生動物體表潰爛、穿孔病、白斑病等病癥[19-20]。值得注意的是，它們可感染國家瀕危保護動物，引起揚子鱷尿酸鹽沉積與華南虎急性死亡[21-22]，造成嚴重物種威脅。卡氏變形桿菌可感染人類，引起傷口化膿等癥狀，也可感染動物。但尚未報道該菌引起動物發病，存在成為繼發性感染細菌的可能性。本試驗從患有呼吸道疾病的肉牛鼻腔中分離到卡氏變形桿菌，并證明其對小鼠具有較強的致病性，應引起高度重視。

卡氏變形桿菌兼具奇異變形桿菌所表現出的群集運動，本研究利用含不同瓊脂濃度的普通培養基測定分離菌株的遷徙能力，結果表明，隨瓊脂濃度(1%、2%、3%)的升高，菌株遷徙能力減弱，與任梅滲等[23]報道的奇異變形桿菌的特性一致。除麥芽糖和蔗糖試驗結果呈陽性外，分離菌株ZZC-JM-1的其他生化特性均與Adesina等[14]報道的人傷口源卡氏變形桿菌生化特性一致。

分離菌株對小鼠有較強的致死性，攻菌后2 h小鼠出現精神沉郁、運動遲緩等癥狀，7～14 h全部死亡，死亡小鼠的肺、肝、脾等器官出現充血、腫大。分離菌株ZZC-JM-1具有較強的耐藥性，僅對喹諾酮類和氨基糖苷類的部分藥物敏感，這是否與其可產生超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases， ESBLs)和攜帶floR耐藥基因有關，尚有待進一步研究。在肉牛養殖過程中，通常會根據臨床發病情況初步選用常規藥物先進行治療，牛場本病發生后立即選用動物專用的內酯類半合成抗生素泰拉霉素和加米霉素進行治療，并有效控制住了病情。根據藥敏試驗結果，還可選用環丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素等藥物治療。