表油菜素內酯對夏黑葡萄幼苗生長的影響

練華山，李欣欣，林立金，廖明安

(1.成都農業科技職業學院 農業園藝學院，四川 成都 611130； 2.四川師范大學附屬第一實驗中學，四川 成都 611130； 3.四川農業大學 果蔬研究所，四川 成都 611130; 4.園藝學院，四川 成都 611130)

1970年，Mitchell等[1]在油菜(BrassicanapusL.)花粉的提取物中發現了一種能促進大豆幼苗生長的物質，被命名為“brassins”。1979年，科學家們從227 kg油菜花粉中分離并提純了brassins，發現這是一種甾類內酯[2]，這類多羥基化且具有相似結構和活性的甾醇類物質都被歸為油菜素內酯類似物(brassinosteroids，BRs)[3]。它們在極低濃度下即可調節和改善植物的生長和發育，被認為是繼生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯之后的第六大植物生長調節劑[4]。在作物上應用的BRs，主要有油菜素內酯(BR)、表油菜素內酯(EBR)、高油菜素內酯(HBR)、丙酰蕓苔素內酯和14-羥基蕓苔素甾醇。其中，EBR是一種人工合成的高活性油菜素內酯類似物，具有促進植物生長發育和提高光合作用的能力[5]。研究表明，外源EBR能夠提高植物的生物量[6]，并且能夠提高植物葉片中的光合色素含量(葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量)和葉片的光化學效率[7]。在植物正常生長發育過程中，植物固有的抗氧化防御系統可以調節和清除少量的活性氧，減少滲透調節物質的產生。近年來，利用外源BRs防御植物的氧化猝滅已引起廣泛關注[8-9]。葉面噴施EBR可以提高植物的抗逆性，包括降低電解質滲透率和丙二醛(MDA)含量[10-11]，增加葉片的相對含水量和游離脯氨酸(Pro)含量，提高抗氧化酶活性等[12-13]。總體上，外源施用EBR對植株的生長特性具有顯著影響。

葡萄(VitisviniferaL.)是世界性果樹，我國葡萄栽培面積位居世界第二[14]，在我國果樹產業中占重要地位。夏黑葡萄是由巨峰×無核白雜交育成的，該品種早熟優質、抗病、豐產、耐貯運性良好[15]。近年來，EBR在提高葡萄產量[16]、促進果實品質形成[17]、緩解非生物脅迫[18]等方面都有較多的研究，但是有關EBR促進葡萄幼苗生長和提高抗氧化系統的研究較少。本研究以夏黑葡萄為材料，研究了葉面噴施不同濃度EBR對葡萄幼苗生長的影響，旨在為提高幼苗抗逆性和培育健壯的夏黑葡萄幼苗提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為夏黑葡萄一年生扦插苗，來源于四川省崇州市四川農業大學現代農業研發基地夏黑葡萄園。2018年冬季修剪時收集生長健壯且長勢一致、無病蟲害的一年生葡萄枝條，進行沙藏保存。

供試土壤為潮土，其基本理化性質如下：pH值7.71，有機質15.29 mg·g-1，全氮0.85 mg·g-1，堿解氮87.99 mg·kg-1，全磷11.88 mg·g-1，速效磷55.78 mg·kg-1，速效鉀41.96 mg·kg-1，全鉀15.38 mg·g-1。

1.2 試驗設計

試驗于2019年2—8月在四川農業大學成都校區進行。2019年2月上旬將無污染的潮土風干、壓碎，過5 mm篩，取3.0 kg裝入盆(高15 cm，直徑18 cm)中，保持濕潤，靜置3周備用。

2019年2月中旬，將沙藏保存的夏黑葡萄插條取出，對其進行修剪(帶一個健壯的飽滿芽，長約7 cm)后扦插于裝有珍珠巖的穴盤(50孔)中，育苗所用珍珠巖為含水量為2%～6%的浮石狀灰白色珍珠巖，置于晝夜為21～23 ℃的人工氣候室中。

2019年3月中旬選取健壯、長勢一致的扦插幼苗(株高約15 cm)移栽到裝有供試土壤的盆中，置于人工氣候室進行培養，白天(24±0.5)℃，夜晚(15±0.5)℃，光周期為12 h/12 h(L/D)，光合有效輻射為200 μmol·m-2·s-1。

幼苗移栽15 d后，分別噴施不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1)的EBR水溶液，對照組噴施等量清水。噴施時間為每天09:00，噴施時以葉面濕潤滴液為度。每個處理每次噴施60 mL，單獨噴施，避免不同濃度交互影響，每隔7 d噴1次，連續噴施3次。每個處理3盆，每盆3株，重復3次。隨機擺放于光照培養室內，盆間距10 cm，每3 d交換位置以減弱邊際效應的影響。

1.3 指標測定

最后一次噴施后第8天，采收樣品，測定相關指標。

1.3.1 生物量

收獲整株夏黑葡萄幼苗，用自來水洗凈，再用去離子水沖洗3次，分為根、莖、葉，于110 ℃殺青15 min，75 ℃烘干至質量不變，用電子天平稱取各部位生物量，并計算根冠比。

1.3.2 氣體交換參數

選取生長點以下第二片完全展開的葉片，用LI-6400便攜式光合儀(Li-CorInc.，USA)進行測定。測定葉片的凈光合速率(photosynthetic rate，Pn)、氣孔導度(conductance stomatal，Gs)、蒸騰速率(transpiration rate，Tr)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)和葉溫下蒸氣壓虧缺值(vapor pressure deficit value at leaf temperature， VpdL)。

1.3.3 光合色素含量

稱取0.2 g幼苗葉片，采用浸泡法測定(乙醇∶丙酮體積比1∶1)，并分別計算葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總葉綠素的含量(葉綠素a含量+葉綠素b含量)[19]。

1.3.4 抗氧化酶活性

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性用氮藍四唑(mitrobluetetrazolium，NBT)光化還原法測定；過氧化物酶(peroxidase，POD)活性用愈創木酚法測定，以每min內D470變化0.1為1個酶活性單位(U·g-1·min-1)；過氧化氫酶(catalase，CAT)活性用高錳酸鉀滴定法測定，以每g鮮重樣品1 min內分解H2O2的毫克數表示(mg·g-1·min-1)[19]。

1.3.5 滲透調節物質

可溶性蛋白質含量用考馬斯亮藍-G250比色法測定；丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量用硫代巴比妥酸法測定；游離脯氨酸含量(proline，Pro)用酸性茚三酮比色法測定；可溶性糖含量用蒽酮比色法測定[19]；相對電導率用電導率儀測定。

1.4 數據處理

用Excel 2010對試驗數據進行記錄和整理；SPSS 20.0進行方差分析和相關性分析；采用Duncan新復極差法進行多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 EBR對夏黑葡萄幼苗生物量的影響

由表1可知，噴施EBR后，葡萄幼苗各部分生物量和總生物量均高于對照組。當EBR為1.0 mg·L-1時，幼苗根的生物量達到最高，比對照組高55.68%(P<0.05)。莖、葉、地上部分和整株生物量的變化具有相同的趨勢，各處理生物量大小排序為：1.5 mg·L-1EBR>1.0 mg·L-1EBR>2.0 mg·L-1EBR>0.5 mg·L-1EBR>對照組，莖、葉、地上部分和整株生物量均在1.5 mg·L-1EBR處理時達到最高，較對照組分別提高114.39%、29.27%、38.47%和42.49%。幼苗的根冠比在0.5 mg·L-1EBR處理時最大，隨后下降，但均高于對照組。綜上，葉面噴施EBR能提高幼苗的生物量。

表1 EBR對夏黑葡萄幼苗生物量的影響

2.2 EBR對夏黑葡萄幼苗光合色素含量的影響

由表2可知，噴施EBR提高了葡萄幼苗的光合色素含量。當葉面噴施EBR為1.0 mg·L-1時，葡萄幼苗的葉綠素a和葉綠素b含量達到最高，分別較對照組提高了33.06%和40.68%。類胡蘿卜素含量在EBR為1.5 mg·L-1時達到最高，較對照組增加了16.56%。總葉綠素含量在EBR為2.0 mg·L-1時達到最高。葉綠素a/b均表現出低于對照組，并且隨EBR濃度的增加呈現下降趨勢。葉綠素含量的變化規律和生物量的變化基本一致，推測噴施EBR促進了葡萄幼苗的光合作用，從而增加了葡萄幼苗的生物量。

表2 EBR對夏黑葡萄幼苗光合色素含量的影響

2.3 EBR對夏黑葡萄幼苗光合參數的影響

噴施EBR顯著提高了葡萄幼苗葉片Tr、Pn、Ci和Gs，而VpdL較對照組顯著降低(表3)。當EBR為0.5 mg·L-1時，葡萄幼苗葉片的Tr達到最大，較對照組提高了27.89%(P<0.05)；EBR為1.5 mg·L-1時次之，較對照組提高了26.01%(P<0.05)。當EBR為1.5 mg·L-1時，Pn、Ci和Gs的值均達到最大，分別較對照組提高158.05%(P<0.05)、39.77%(P<0.05)和50.00%(P<0.05)；EBR為0.5 mg·L-1時次之，且較對照組提高了105.49%(P<0.05)、27.02%(P<0.05)和43.75%(P<0.05)。葉面噴施不同濃度EBR顯著降低了葡萄幼苗葉片的VpdL，1.5 mg·L-1EBR處理的VpdL降低幅度最小，較對照組減少了8.61%(P<0.05)。

表3 EBR對夏黑葡萄幼苗光合參數的影響

2.4 EBR對夏黑葡萄幼苗抗氧化酶活性的影響

葉面噴施EBR提高了葡萄幼苗的抗氧化酶(POD、SOD和CAT)活性，且隨EBR濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(表4)。當EBR為1.0 mg·L-1，葡萄幼苗的SOD、POD與CAT的活性達到最高，分別較對照組提高了70.74%(P<0.05)、52.73%(P<0.05)和123.26%(P<0.05)，在1.5 mg·L-1EBR處理時次之。

表4 EBR對夏黑葡萄幼苗抗氧化酶活性的影響

2.5 EBR對夏黑葡萄幼苗滲透調節物質含量的影響

由表5可知，葉面噴施不同濃度EBR，葡萄幼苗葉片中MDA含量均低于對照組，且在1.0 mg·L-1EBR處理時達到最低，較對照組降低了43.75%(P<0.05)。葉面噴施EBR后，葡萄幼苗葉片中脯氨酸和可溶性蛋白質含量均高于對照組，EBR濃度為1.0 mg·L-1時達到最高，較對照組分別增加了50.90%(P<0.05)和50.28%(P<0.05)。當EBR濃度為0.5 mg·L-1和2.0 mg·L-1時，葉片中的相對電導率均顯著高于對照組，較對照組分別增加了6.25%(P<0.05)和3.22%(P<0.05)，其余濃度處理則顯著低于對照組。

表5 EBR對夏黑葡萄幼苗滲透調節物質含量的影響

2.6 EBR對夏黑葡萄幼苗可溶性糖含量的影響

由表6可知，葉面噴施EBR后葡萄幼苗葉片各部位的可溶性糖含量變化趨勢不同。除了0.5 mg·L-1EBR處理，葉面噴施EBR后葡萄幼苗根的可溶性糖含量均高于對照組，其中，EBR為2.0 mg·L-1時達到最高，較對照組增加了59.57%(P<0.05)。0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1EBR處理的葡萄幼苗莖的可溶性糖含量低于對照組，其余處理均顯著高于對照組；EBR為2.0 mg·L-1時達到最高，較對照組增加了14.03%(P<0.05)。1.5 mg·L-1和2.0 mg·L-1EBR處理的葡萄幼苗葉片可溶性糖含量低于對照組，其余處理均顯著高于對照組， EBR為1.0 mg·L-1時達到最高，較對照組增加了38.19%(P<0.05)。

3 討論

BRs能促進植物細胞的伸長和分裂，提高生物量[20]。葉面噴施不同濃度的EBR提高了夏黑葡萄幼苗的生物量和根冠比。適宜濃度EBR促進植物的幼莖伸長、提高幼苗生物量的主要原因如下：一是與植物激素的相互作用，EBR與生長素能夠相互作用，加快細胞分裂；二是EBR會刺激質膜上的ATP酶活性，使質膜分泌產生的H+轉移到細胞壁，從而使細胞伸長[21]，提高植物幼苗的生物量。

葉綠素分子以色素—蛋白質復合物的形式存在于葉綠體中，不僅吸收和傳遞光能，還可將光能轉化為電能，其含量的多少及其組成決定了植物對不同光的吸收和利用率。葉綠素a/b的值反映了類囊體膜的垛疊程度，且成正相關，其數值降低代表膜垛疊減少，導致植物對光量子的有效吸收、傳遞和利用降低，從而降低光能轉化為生物化學能的效率[22]。有關EBR影響光合作用的研究中發現，EBR參與光形態建成和光信號傳導[23]。對馬鈴薯幼苗葉面噴施不同濃度的EBR時，幼苗葉片中的光合色素含量顯著下降，但是葉綠素a/b并未出現顯著變化[24]。葉面噴施不同濃度EBR提高了葡萄幼苗的光合色素(葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素)含量，降低了葉綠素a/b的值，其原因可能是幼苗葉面噴施EBR后葉綠素b含量增加，可以增加對光能的捕獲，但是幼苗的光合作用能力有限，過多的光能會使活性氧產生，從而增加蛋白質的降解[25]，進而影響核心光系統蛋白質含量與光合復合物蛋白質含量的比值，使得葉綠素a/b的值發生變化[23]。隨著光合色素含量的增加，氣體交換參數也發生了變化：噴施不同濃度EBR的葡萄幼苗葉片氣體參數(Tr、Pn、Ci、Gs)都顯著增加，VpdL顯著降低。VpdL的降低增加了葉片的水分利用效率，能夠促進光合作用[26]。研究表明，BRs可提高小麥葉片1， 5-二磷酸核酮糖羧化酶的活性，使葉片吸收CO2的速度加快，提高光合速率[27]。當外源施用有益物質時，可能會提高植物PSⅡ(photosynthetic systemⅡ)的光化學活性，使光合酶如PEP羧化酶、RuBP羧化酶活性上升，增強光合電子向電子受體(QA、QB)與質體醌(PQ)的傳遞，從而改變光系統的運轉效率[28]，影響光合參數。

植物在正常生長過程中會產生過量活性氧，但是植物體內的SOD、POD、CAT等抗氧化酶能夠及時清除過多的活性氧，從而保護植物免受活性氧的傷害。Tadaiesky等[29]研究發現，外源EBR提高了植物SOD、CAT、POD、APX(ascorbate peroxidase)等抗氧化酶的活性，減輕了氧化損傷。Kohli等[30]的研究也表明，SOD、POD、CAT等抗氧化酶基因表達水平的升高可能是EBR處理后抗氧化防御系統活性增強的原因。葉面噴施EBR提高了夏黑葡萄幼苗葉片抗氧化酶活性。這與Tadaiesky等[29]在水稻上和Kohli等[30]在芥菜上的試驗結果相似。推測外源EBR使這些酶活性升高的原因如下：一是EBR可能調節各種抗氧化酶基因的表達，因為這些基因介導酶的活性和從頭合成[31]；二是BRs能調控細胞內的信號傳導，如BR信號激酶1(BSK 1)，能夠接受不利影響的信號，從而調節植物細胞內源性水楊酸的水平[32]，影響抗氧化系統。

植物細胞膜對維持細胞的微環境和正常代謝起著重要的作用。在正常情況下，細胞膜對物質具有選擇透性能力；如果細胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細胞內電解質外滲，以致植物細胞的電導率增大。葉片噴施不同濃度EBR提高了葡萄幼苗葉片的脯氨酸和可溶性蛋白質的含量，降低了MDA含量；不同濃度EBR對葡萄幼苗根、莖和葉中的可溶性糖含量影響不同，0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1EBR處理提高了葉片的可溶性糖含量；當EBR濃度為1.0 mg·L-1和1.5 mg·L-1時，葉片的相對電導率降低。這些結果與Peng等[33]和Zhong等[11]的結果相似，即EBR可以使幼苗通過增加可溶性糖、可溶性蛋白質、脯氨酸等滲透調節物質的含量來提高幼苗的抗性，保護細胞結構和功能，但是不同濃度EBR對植株葉片的滲透調節作用不同。

本研究結果表明，葉面噴施不同濃度EBR促進了夏黑葡萄幼苗葉片的生長，其生物量、光合色素含量、光合參數、抗氧化酶活性、可溶性蛋白質和脯氨酸的含量都有所提高，且EBR濃度為1.0 mg·L-1和1.5 mg·L-1時效果最好；EBR濃度為1.0 mg·L-1時，葡萄幼苗葉片可溶性糖和相對電導率表現較好。綜上所述，葉面噴施1.0 mg·L-1EBR最有利于夏黑葡萄幼苗生長。