基于Wolff-Kishner-黃鳴龍法合成紅火蟻告警信息素及其觸角電位反應

王麗坤，黃 俊，章金明，李曉維，張治軍，MUHAMMAD Hafeez，呂要斌，*

(浙江省農業科學院 a.農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室(籌)，浙江 杭州 310021； b.植物保護與微生物研究所，浙江省植物有害生物防控重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021)

紅火蟻(SolenopsisinvictaBuren)是一種重要的農林業害蟲，也是世界自然保護聯盟(International Union for Conservation of Nature，IUCN)收錄的最具有破壞力的入侵生物之一[1]，目前已經入侵我國15個省份，造成嚴重危害。紅火蟻不僅入侵能力強，擴散速度快，而且能對人畜造成極其嚴重的危害[2-4]。作為典型的社會性昆蟲，紅火蟻具有明顯的等級分化和個體分工。一個成熟的紅火蟻蟻巢由幾萬至幾十萬頭大小工蟻、幾百頭有翅雌蟻和有翅雄蟻、1頭或多頭蟻后及未成年的個體(卵、幼蟲與蛹)組成[5]，目前我國發現入侵紅火蟻種群基本上為多蟻后型。紅火蟻不同品級之間之所以能夠保持高度有序的分工和分配，主要依靠相關腺體分泌的信息素物質，如杜氏腺(Dufour’s gland)產生跟蹤信息素(trail pheromone)、下頜腺(mandibular gland)產生告警信息素(alarm pheromone)等[6-7]。

告警信息素指由昆蟲釋放并能引起同種個體釆取防御行為的化學物質，是社會性昆蟲一項重要的信息素物質。紅火蟻告警信息素的主要成分為2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，該化合物能夠引起紅火蟻強烈的告警反應。研究表明，工蟻、雌蟻、雄蟻和蟻后均能產生告警信息素，在婚飛過程中，雄蟻、雌蟻告警信息素的含量也發生顯著變化，因此，推測該化合物很可能參與紅火蟻婚飛等過程[8-9]。此外，告警信息素還對紅火蟻的重要天敵——寄生性蚤蠅有強烈的引誘作用[10-11]。然而，由于紅火蟻告警信息素在昆蟲體內含量極低，腺體成分復雜，難以直接分離純化，且商品化的標準品為2-乙基-3，6-二甲基吡嗪(40%)和2-乙基-3，5-二甲基吡嗪(60%)的混合物[12-14]，因此極大地限制了紅火蟻告警信息素的發展和應用。

Wolff-Kishner-黃鳴龍還原法是一個重要的有機反應，它是將羰基還原成為亞甲基的常用方法之一[15]，因此，本文基于該合成方法，通過一步反應獲得2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，利用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)和標準品對合成化合物進行結構鑒定，并通過觸角電位儀(EAG)測定紅火蟻工蟻對不同濃度2-乙基-3，6-二甲基吡嗪的反應。

1 材料與方法

1.1 供試紅火蟻

紅火蟻采集于浙江省永康市新樓村(東經120°22′28″，北緯28°85′71″)，將整個蟻巢挖回，室內經水滴法分離得到紅火蟻，利用黃粉蟲(Tenebriomolitor)飼養，每個蟻群每天飼喂3～4頭黃粉蟲。紅火蟻采集、分離和飼養方法參照呂利華等[16]和孫延勇等[17]的方法。

1.2 供試試劑

1-(3，6-二甲基吡嗪-2-基)乙酮(95%)、水合肼(85%)和二聚乙二醇(AR)購自國藥集團化學試劑有限公司(SCR?，上海)，氫氧化鉀購自上海麥克林生化科技有限公司，2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪(分析標準品，異構體混合物，純度99%)購自阿拉丁生化科技股份有限公司(Aladdin?，上海)，其他所需試劑均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司(Sigma-Aldrich)，其中，乙酸乙酯為分析純(AR)，正己烷為色譜純(HPLC， 99%)。

1.3 紅火蟻告警信息素合成

將1-(3，6-二甲基吡嗪-2-基)乙酮(180.1 mg，1.2 mmol·L-1)加入到溶有85%水合肼(357.2 mg，6 mmol·L-1)的二聚乙二醇(30 mL)溶液中，緩慢升溫至150 ℃反應2 h，冷卻至室溫后加入氫氧化鉀(269.3 mg，4.8 mmol·L-1)，逐漸加熱至180 ℃，再回流反應4 h。薄層色譜(TLC)檢測反應完全后，將反應體系冷卻至室溫，加入30 mL水。用乙酸乙酯萃取(20 mL×3)，合并有機相后經無水硫酸鎂干燥、過濾和旋蒸后得到粗品，再經柱層析色譜(乙酸乙酯∶石油醚1∶20)分離得到淡黃色產物，收率為85%，經GC-MS和市售標準品對產物進行結構鑒定。反應路線如圖2所示。

1.4 GC-MS分析

將化合物用正己烷(99%，色譜級)溶解，經氣相色譜-質譜(GC-MS，SHIMADZU GC-MS-QP2010 Plus)對化合物進行分析。色譜柱Rxi-5ms(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升溫程序：起始溫度50 ℃，10 ℃·min-1至150 ℃，25 ℃·min-1至250 ℃，保持5 min；進樣量1 μL，不分流；載氣為He(>99.999%)；離子源為EI，離子源溫度200 ℃，進樣口溫度250 ℃；電子能量70 eV；掃描質量范圍40～500m/z。

1.5 觸角電位反應(EAG)

EAG測定方法參照Guan等[18]和Li等[19]。用手術刀切下紅火蟻工蟻頭部，切口端與充滿Ringer’s電生理鹽水的參比電極相連，觸角的尖端連接記錄電極。電極通過銀-氯化銀絲與信號放大器連接，信號通過探針檢測(INR-II， Syntech?， the Netherlands)，利用EAG2000軟件(Syntech?，the Netherlands)記錄和分析數據。取10 μL待測樣品，均勻涂抹在濾紙條上，放入巴斯德管中，平衡30 s后用于刺激紅火蟻，觀察電位的變化。為了保證所有的待測紅火蟻工蟻在測試過程中的活性與數據的有效性，實驗溶劑正己烷作空白對照，分別比較合成的告警信息素與市售的2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪標準樣品的觸角電位反應，在待測樣品測試之前和結束之后兩個對照各測試一次，取平均結果。若測試之前，陽性樣品反應過小，則另挑選強壯的工蟻測試。測試過程中，兩種化合物各設置5個濃度，分別為0.001、0.01、0.1、1和10 mg·mL-1，每個濃度重復5次。測試時間頻率是0.2 s，空氣的流速為800～1 000 mL·min-1。為確保實驗的準確性，第2次刺激與第1次刺激之間需要間隔1 min。

2 結果與分析

2.1 紅火蟻告警信息素合成

通過Wolff-Kishner-黃鳴龍還原法，將1-(3，6-二甲基吡嗪-2-基)乙酮在強堿作用下還原成2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，反應產物經GC-MS和標準品進行對比分析。從總離子流色譜圖(TIC)可以看出(圖3)，市售標準品有兩個明顯的峰，根據文獻[20-21]和標準品產品信息可以確定保留時間6.28 min的化合物1為2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，6.38min的化合物2為2-乙基-3，5-二甲基吡嗪。在相同色譜條件下對合成化合物進行GC-MS分析，在TIC圖譜中合成化合物的保留時間為6.27 min，與標準品中化合物1相對應；進一步對合成化合物的分子離子峰及其碎片信息進行分析，分子量m/z135的碎片豐度為100%，因此可以判斷出該峰為準分子離子峰，主要由分子失氫裂解形成，即[M-H]+峰；由準分子離子進一步裂解，通過失去CH3、CHN、CH3CN和CH3CH2CN后分別得到m/z 121、108、94、80的碎片(圖4)。進一步利用標準品對合成化合物1進行定量分析，化合物1的純度為90.2%。

2.2 合成紅火蟻告警信息素 EAG分析

EAG實驗結果如圖5所示，標準品和合成化合物均能引起工蟻強烈的觸角電位反應，隨著濃度的增加紅火蟻工蟻觸角對化合物的反應逐漸增強，當劑量達到200 μg時反應最強。劑量為0.01、0.1、1、10和200 μg時，標準品和合成化合物之間沒有顯著差異(P>0.05)。然而，當樣品劑量為100 μg時，標準品和合成化合物之間差異顯著(P<0.05)。

3 討論

Wolff-Kishner-黃鳴龍還原反應是有機化學中經典的有機人名反應之一，該方法是第一個以華人命名的有機化學反應[15]。本研究通過設計和相關檢索，首次利用該還原法合成紅火蟻告警信息素。在水合肼和強堿共熱下，將1-(3，6-二甲基吡嗪-2-基)乙酮中的羰基還原成亞甲基，從而實現化合物2-乙基-3，6-二甲基吡嗪的合成。該反應簡單易操作，原料易得，反應收率高，能夠有效減少副反應的發生，且產物中不會有同分異構體2-乙基-3，5-二甲基吡嗪生成，大大降低了分離難度。

目前，已有多種方法合成2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，如Bohman等[22]利用Minisci反應將2，5-二甲基吡嗪在強酸作用下發生取代反應生成2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，然而該反應需要大量的濃硫酸和雙氧水，且后處理調pH過程中會釋放大量的熱量，容易造成產物揮發或分解。該合成方法僅適用于微量反應，不適合工藝放大，難以獲得大量產物。Adams等[23]利用美拉德反應(Maillard反應)合成2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，然而，該方法制備得到的產物中會有較多的副產物生成，難以分離提純，不易于得到較高純度的目標產物。

告警信息素是由一種昆蟲釋放并能引起同種個體釆取防御行為的化學物質。這類信息素主要存在于群集性或社會性昆蟲中。告警是螞蟻一種非常明顯的行為之一，當遇到外界的壓力和威脅時，螞蟻會釋放告警信息素，給同伴發出警告信號。蟻巢會針對即將發生的危險部署工蟻及兵蟻做好相應的措施。目前已有大量關于紅火蟻告警信息素及其類似物的相關報道，相關研究指出告警信息素及類似物能夠引起紅火蟻強烈的行為反應，如引誘、趨避和聚集等行為[18]。

此外，吡嗪類化合物廣泛存在于螞蟻中，是螞蟻中重要的信息素類物質。如猛蟻下頜腺中含有大量吡嗪類化合物，其中2位為烷基取代的3，5-二甲基吡嗪類化合物最為豐富[24-25]；多種收獲蟻(Pogonomyrmex)毒腺的主要成分均為烷基吡嗪類化合物，如2，5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪和3-乙基-2，5-二甲基吡嗪等[26]。2-乙基-3，6-二甲基吡嗪不僅是紅火蟻的告警信息素，而且也廣泛分布在其他螞蟻中，起到相關信息傳遞和交流的作用，如2-乙基-3，6-二甲基吡嗪是P.barbatus、P.maricopa、P.occidentalis和P.rugosus4種收獲蟻的招募信息素(recruitment pheromone)。

盡管本研究成功合成出紅火蟻告警信息素，然而還需對告警信息素的作用機制及其田間活性進行分析和驗證。通過利用告警信息素對紅火蟻的特殊作用方式，結合紅火蟻田間防治方法，探索出一種基于信息素的紅火蟻田間監測和防治技術。