新煙堿類殺蟲劑對家蠶的急性毒性與風險評價

柳新菊，吳聲敢，安雪花，蔣金花，呂 露，李 崗，王菲迪，趙學平

(浙江省農業科學院 農產品質量安全和營養研究所，農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，浙江 杭州 310021)

蠶桑業是我國傳統產業之一，現擁有世界絲綢70%的產業規模[1]。家蠶(Bombyxmori) 是一種具有很高經濟價值的泌絲昆蟲[2]。而家蠶在長期馴養過程中，由于人為提供適合其生長發育的環境條件，使其在經濟性狀得到充分表現的同時，抗逆性明顯減弱，極易受到外界各種不良因素的影響[3]。桑葉是家蠶的唯一食料，桑葉受到污染后會對蠶桑業造成嚴重威脅[4]。在我國，由于農桑混植比較普遍，農田使用農藥發生飄移以及桑園病蟲害防治用藥不當都可能會導致桑葉污染，從而引起家蠶農藥中毒，影響其生長發育[5-6]。每年因農藥殘留造成的家蠶中毒事件可導致我國蠶繭產量損失在30%以上[7]。鑒于化學防治仍是當前國內外控制農作物病蟲害的重要手段，農藥在使用過程中不可避免地會對生態環境非靶標生物造成不利影響[8]。因此，開展農藥對家蠶的毒性評價測試及其在蠶區周圍環境使用的風險評估，對于確保養蠶生產安全和降低蠶業風險尤為重要[9]。

新煙堿類殺蟲劑是目前世界上使用量最大的殺蟲劑類別，該類藥劑在使用初期被普遍認為對生態環境的危害較低[10]。然而隨著該類藥劑的大量廣泛使用，其對生態環境和人類健康的不利影響逐漸表現出來[11]。國內外許多學者研究表明，新煙堿類殺蟲劑的使用是引起歐洲和北美洲蜜蜂種群產生種群崩潰失調(colony collapse disorder，CCD)的重要因素[12-13]。盡管已有文獻報道新煙堿類殺蟲劑制劑對家蠶的急性毒性評價，但不同的農藥廠家在加工新煙堿類殺蟲劑制劑時使用的農藥助劑可能不同，不能反映出該類藥劑活性分子對家蠶的真正毒性效應[14-15]。因此，本研究以我國農業生產中使用量較大的傳統農藥有機磷類殺蟲劑(毒死蜱與馬拉硫磷)和擬除蟲菊酯類殺蟲劑(高效氯氟氰菊酯)為對照藥劑，評價新煙堿類殺蟲劑原藥對家蠶的急性毒性，并進行初步風險評估，旨在為蠶區桑園及周圍農田合理使用新煙堿類殺蟲劑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試生物

家蠶品種為菁松×皓月，蠶種由浙江省蠶種質量檢驗檢疫站提供。用常規方法催青和飼養，恒溫養蟲室溫度為(25±2)℃，相對濕度為70%～85%，光照黑暗比為16 h∶8 h。

1.2 測試藥劑

1.2.1 新煙堿類殺蟲劑

96%啶蟲脒(acetamiprid)原藥，江蘇常隆化工有限公司；96.5%噻蟲胺(clothianidin)原藥，湖南比德生化科技有限公司；95%呋蟲胺(dinotefuran)原藥，江蘇常隆化工有限公司；97%吡蟲啉(imidacloprid)原藥，南京紅太陽集團有限責任公司； 97.5%噻蟲啉(thiacloprid)原藥，湖南比德生化科技有限公司；98%噻蟲嗪(thiamethoxam)原藥，上虞穎泰精細化工有限公司。

1.2.2 對照藥劑

有機磷類殺蟲劑：97%毒死蜱(chlorpyrifos)原藥，江蘇常隆化工有限公司；95%馬拉硫磷(malathion)原藥，江蘇騰龍生物藥業有限公司。擬除蟲菊酯類殺蟲劑：96.5%高效氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)原藥，農業農村部農藥檢定所提供。

1.3 急性毒性測試方法

采用我國《化學農藥環境安全評價試驗準則》中推薦的浸葉法[16]。試驗前，將供試原藥用丙酮與吐溫-80配制成一定濃度母液，進行預備試驗初步確定正式試驗的濃度范圍。正式試驗時將各種藥劑用0.1%吐溫-80分別稀釋成5～7個系列濃度。試驗時取整片桑葉浸沒于不同濃度的試驗溶液中(10±2)s，自然晾干后剪成長方形并轉入直徑9 cm 培養皿內。以清水浸漬桑葉為空白對照，以含丙酮與吐溫-80的水溶液作為溶劑對照，試驗組、溶劑對照組和空白對照組均設3個平行，每平行20頭2齡起蠶。將處理后的試蟲置于溫度為(25±2) ℃、相對濕度為70%～85%植物培養箱內連續取食桑葉96 h，觀察并記錄 24、48、72、96 h供試家蠶的中毒癥狀及死亡情況。對照組死亡率<10%的試驗為有效試驗，且用鑷子輕觸蟲體無反應視為死亡。根據藥劑各濃度組設定濃度與對應的死亡率，采用“DPS數據處理系統”18.1高級版計算各種藥劑對家蠶的毒性回歸方程，半致死濃度(LC50)與95%置信限。

1.4 毒性等級劃分依據

根據我國農藥對家蠶的毒性等級劃分標準[16]，將急性毒性分為4個等級: 當LC50≤0.5 mg·L-1時，農藥對家蠶為劇毒，0.5 mg·L-1200 mg·L-1時農藥對家蠶為低毒。以藥劑對家蠶的LC50作為判斷毒性等級的標準。

1.5 初級風險評估

1.5.1 初級暴露分析計算方法

根據農藥的使用方法和家蠶的暴露途徑，選擇飄移場景下對其進行風險評估。根據指南NY/T 2882.5—2016[17]要求，按公式(1)和公式(2)分別計算多次施藥后最外圍桑樹上的預測暴露濃度(PECma-fr)和次外圍桑樹上的預測暴露濃度(PECma-sr)。

Vfr=VAR×R95×DPHI×MAF×Pfr；

(1)

Vsr=VAR×R95×DPHI×MAF×Psr。

(2)

式中：Vfr表示PECma-fr的值；Vsr表示PECma-sr的值；VAR表示單位面積農藥最高使用劑量(AR，單位為kg·hm-2)的值；Pfr表示最外圍一行桑樹上的漂移因子；Psr表示次外圍一行桑樹上的漂移因子；R95表示類似桑樹的作物第95百分位的單位殘留量(單位為mg·kg-1桑葉)/(kg·hm-2)；DPHI表示桑葉上農藥的降解系數，可根據公式DPHI=e-ln2×PHI/DT50計算；式中DT50表示農藥在桑葉上的降解半衰期，單位為d，采用默認值10 d；PHI表示農藥最后一次使用距離桑葉采收的間隔期，單位為d，采用默認值1 d。MAF為多次施藥因子，可根據MAF=(1-e-n×i×ln2/DT50)/(1-e-i×ln2/DT50)計算；式中n表示施藥次數，i表示施藥間隔期，單位為d。

1.5.2 初級效應分析

按照公式(3)計算預測無效應濃度(CPNE)。

(3)

式中:VEnP表示急性毒性終點(EnP，單位為mg·kg-1桑葉)的值，EnP采用急性毒性試驗的LC50，其單位為mg·L-1；FU為不確定因子。初級效應分析中選擇不確定性因子為70。

1.5.3 風險表征

按照公式(4)計算風險商值(RQ)。

(4)

式中：VRQ為RQ的值；CPE表示預測暴露濃度(單位為mg·kg-1桑葉)；CPNE表示預測無效應濃度(單位為mg·kg-1桑葉)。當RQ≤1，風險可接受；當RQ>1，則風險不可接受。

2 結果與分析

2.1 測試藥劑對家蠶的中毒癥狀

2 齡起蠶經過不同類別的殺蟲劑添食處理后，中毒癥狀有很大差異，食下新煙堿類殺蟲劑的家蠶幼蟲多數出現拒食、胸部膨大、體色發黑、體縮，扭曲呈“C”或“S”形等中毒癥狀；而食下擬除蟲菊酯類殺蟲劑高效氯氟氰菊酯的家蠶幼蟲出現拒食、吐液、身體扭曲、側倒死亡等癥狀; 食下有機磷類殺蟲劑毒死蜱和馬拉硫磷的家蠶幼蟲與食下新煙堿類殺蟲劑的主要中毒癥狀相似，食下馬拉硫磷的家蠶幼蟲還出現吐液癥狀；6種新煙堿類殺蟲劑引起家蠶幼蟲的中毒癥狀基本相似，主要表現出拒食、身體呈“C”和“S”形扭曲的癥狀; 但個別藥劑也有不同，如食下噻蟲嗪和啶蟲脒的家蠶幼蟲均有吐液癥狀。測試藥劑對家蠶的中毒癥狀如圖1所示。空白對照未出現中毒癥狀。

2.2 測試藥劑對家蠶的急性毒性

由表1可知，6種新煙堿類殺蟲劑中，啶蟲脒和噻蟲胺對家蠶 2 齡幼蟲 96 h-LC50分別為 0.262、0.268 mg·L-1，毒性都很高，但其毒性均低于擬除蟲菊酯類殺蟲劑高效氯氟氰菊酯(LC50為0.009 09 mg·L-1)；噻蟲啉、吡蟲啉、呋蟲胺和噻蟲嗪的LC50分別為 0.582、1.68、2.60、2.16 mg·L-1，與有機磷類殺蟲劑毒死蜱的毒性相近，毒性也較高。馬拉硫磷對家蠶 2 齡幼蟲 96 h 的LC50為1 072 mg·L-1，則為低毒，空白對照未出現死亡現象。根據我國農藥對家蠶的毒性等級劃分標準，啶蟲脒、噻蟲胺和高效氯氟氰菊酯屬于劇毒級，噻蟲啉、吡蟲啉、呋蟲胺、噻蟲嗪和毒死蜱均屬于高毒級，馬拉硫磷屬于低毒級。9種農藥對家蠶的急性毒性(96 h結果)次序為：高效氯氟氰菊酯>啶蟲脒>噻蟲胺>噻蟲啉>毒死蜱>吡蟲啉>噻蟲嗪>呋蟲胺>馬拉硫磷。

表1 新煙堿類殺蟲劑及其他3種殺蟲劑對家蠶的急性毒性

2.3 風險評價

2.3.1 初級暴露分析

9種殺蟲劑對家蠶暴露分析結果如表2所示，通過中國農藥信息網農藥登記信息數據庫并結合參考文獻，查詢各農藥在我國登記的田間最高噴霧施用劑量、施用次數和施藥間隔，按最高風險原則收集數據；采用飄移場景多次施藥的情況進行暴露分析，進而對初級風險進行定量描述。初級風險評估時R95采用默認值950 (mg·kg-1)/(kg·hm-2)，Pfr采用默認值9.8%，Psr采用默認值0.6%。

表2 不同殺蟲劑對家蠶的暴露分析

2.3.2 初級效應分析和風險表征

9種殺蟲劑對家蠶的初步效應分析和風險表征結果見表3和表4，根據指南NY/T 2882.5-2016[18]，采用家蠶的急性毒性(浸葉法)96 h-LC50為急性毒性終點。LC50單位為 mg·L-1，EnP采用急性毒性試驗的LC50，單位為mg·kg-1桑葉，因單位不同，需按公式LC50-C=LC50×FC修正，其中LC50-C表示修正半致死濃度，單位為mg·kg-1桑葉；FC表示修正系數。得到修正半致死濃度LC50-C后，帶入風險商公式(4) 計算求得RQ值。初級風險評估結果表明：在飄移場景下，最外圍桑樹的RQ值均大于1，次外圍桑樹的RQ值除馬拉硫磷外均大于1，說明這9種殺蟲劑在目前登記的田間最高施用劑量下以最外圍桑樹的桑葉飼喂家蠶，對家蠶的風險均不可接受。9種殺蟲劑在以次外圍桑樹的桑葉飼喂家蠶，除馬拉硫磷對家蠶的風險可接受外，其余均不可接受。9種農藥對家蠶的風險次序為: 高效氯氟氰菊酯>毒死蜱>噻蟲胺>啶蟲脒>噻蟲啉>吡蟲啉>呋蟲胺>噻蟲嗪>馬拉硫磷。

表3 不同殺蟲劑對家蠶的初級效應分析

表4 不同殺蟲劑對家蠶的初級風險評估

3 討論

鑒于家蠶在我國農業生態系統和農業經濟中的重要性，有關農藥對家蠶的毒性測試方法和安全評價工作已有不少報道[19-20]。國內外學者評價家蠶的急性毒性主要包括浸葉法、藥膜法、熏蒸法和口器注入等測試方法[5，8，18，21]。總體來看，浸葉法能全面反映農藥對家蠶的胃毒、觸殺和熏蒸毒性，與田間農藥對家蠶的實際危害接近，且該方法操作簡單和重復性好，可為風險評價提供可靠且科學的毒性終點[19]。因此，本研究采用浸葉法評價了新煙堿類殺蟲劑對家蠶的急性毒性效應。

本研究結果表明，新煙堿類殺蟲劑啶蟲脒和噻蟲胺對家蠶為劇毒級別，而其余的4種藥劑為高毒級別。總體來看，測試的6種新煙堿類殺蟲劑對家蠶表現出高毒—劇毒級別，這與崔新倩等[14]的報道基本一致，但本研究測試的啶蟲脒對家蠶96 h-LC50顯著低于其報道的2.73 (2.34～3.20) mg· L-1，而噻蟲胺、噻蟲啉、吡蟲啉和噻蟲嗪對家蠶96 h-LC50分別顯著高于其報道的0.065 (0.051～0.083)、0.26 (0.22～0.30)、0.17 (0.15～0.21) 和1.31 (1.12～1.54) mg· L-1，這可能是由于本研究采用的是新煙堿類殺蟲劑原藥而文獻報道采用的是新煙堿類殺蟲劑相應的制劑。農藥加工過程中使用的助劑可能影響殺蟲劑的毒性，這可能是因為助劑本身有毒，也可能是因為助劑中的某些成分增加了殺蟲有效成分向家蠶體壁的滲透，從而影響了農藥整體毒性，還有可能是因為助劑中的某些成分改變了家蠶對于農藥有效成分的代謝能力等[22]。此外，本研究的對照藥劑毒死蜱對家蠶96 h-LC50顯著低于崔新倩等[14]報道的1.51 (1.29～1.71) mg·L-1，而高效氯氟氰菊酯對家蠶96 h-LC50顯著高于戴建忠等[23]報道的0.004 6 (0.003 7～0.005 2) mg·L-1，這也可能是由于本研究采用的是殺蟲劑原藥，而文獻報道采用的是對應的制劑，制劑中的助劑影響了殺蟲劑有效成分的毒性。但總體來看，對照藥劑毒死蜱和高效氯氟氰菊酯原藥和對應的制劑對家蠶的急性毒性級別分別是一致的。

已有研究表明，含硝基的新煙堿類殺蟲劑(吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、烯啶蟲胺和呋蟲胺)比含氰基的殺蟲劑(啶蟲脒和噻蟲啉)對蜜蜂的毒性更大，其原因可能是含氰基新煙堿類殺蟲劑可快速地被生物轉化和代謝降解[24]。由于含有硝基的新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂具有極高的毒性效應，部分歐洲國家(法國)在2018年9月1日已經開始部分禁用新煙堿類殺蟲劑，但在世界范圍內新煙堿類殺蟲劑的市場占有率仍然很高，這意味著各種非靶標生物仍會暴露于該類殺蟲劑中[10]。目前，新煙堿類殺蟲劑對生物毒性效應表征較多，而對致毒機理探究較少；對單一化合物暴露較多，而對多個化合物聯合暴露較少[25]。今后應在如下幾方面加強研究：(1) 結合多種分析手段在不同水平上揭示新煙堿類殺蟲劑對不同水平物種生物的致毒機理；(2) 多種新煙堿類殺蟲劑與其他農藥聯合暴露時對不同生物物種的毒性效應與機理。這些研究有助于進一步為新煙堿類殺蟲劑的風險評估和合理施用提供科學依據。

本研究評價了新煙堿類殺蟲劑對家蠶的急性毒性效應，但在農田生態系統中，農藥的大量廣泛使用，對桑葉及蠶室周圍可能造成不同程度的輕度污染，家蠶有可能暴露到農藥的慢性毒性[26]。研究發現，家蠶接觸微量慢性毒性較大的農藥后，雖然死亡率很低或者無死亡，但蠶體正常的生長發育和生理代謝受到干擾，造成眠蠶體質量下降、眠起不齊、發育歷期延長等，同樣會給養蠶業造成較大的經濟損失[7]。因此，預防農藥污染引起的家蠶慢性毒性也應受到重視。

本試驗開展了9種殺蟲劑對家蠶的初級風險評估。通過暴露分析、效應分析和風險表征研究，結果顯示：在目前登記的田間最高施用劑量下以最外圍桑樹的桑葉飼喂家蠶，對家蠶的風險均不可接受；在以次外圍桑樹的桑葉飼喂家蠶，除馬拉硫磷對家蠶的風險可接受外，其余均不可接受。在效應分析時，由于受環境條件等影響，僅用單個毒性測定值來計算預測無效應濃度，不一定能保證預測無效應濃度的數據質量。下一步可以考慮結合慢性試驗，提高預測無效應濃度的數據質量。

風險評估結果顯示，多次施藥飄移場景下，以最外圍桑樹及次外圍桑樹的桑葉飼喂家蠶，新煙堿類殺蟲劑對家蠶的風險均不可接受。由于其具有良好的根部內吸性，且殘效期長，在桑園周邊田間使用時，建議：一是在養蠶期間避免在蠶室和桑園附近使用該類藥劑；二是桑葉采摘時注意施藥安全間隔期；三是在蠶期可選擇其他低毒性殺蟲劑，如采用文中試驗次外圍桑樹的桑葉飼喂家蠶風險較低的馬拉硫磷替代。