基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術對分枝桿菌液體培養系統菌種鑒定的臨床研究

杜巖青，秦中華，張麗霞

不同種分枝桿菌感染疾病的臨床癥狀、影像學特征十分相似，但在致病性、藥物敏感性、治療方案上常截然不同，若無準確的病原學證據，可能造成誤診,因此快速、準確到種甚至亞種的病原學鑒定對于分枝桿菌的確診及治療具有重要意義。

當前國內外實驗室主要采用液體、固體2種方法進行分枝桿菌的培養，固體培養既為傳統的羅氏培養法耗時較長，需4～6周。液體培養系統使用的自動化培養系統如BactecTMMGITTM960(BD Diagnostics, Sparks,Maryland,USA)，1～3周即可檢測到分枝桿菌的生長，較傳統的固體培養更為敏感和快速，但無法區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，仍需進一步進行鑒定。

對于分枝桿菌的診斷，傳統的生化鑒定方法操作復雜，影響因素多，耗時長，結果不準確，目前已不常使用，分子診斷技術的方法主要是比較同源基因或序列差異的方法[1]，由于方法復雜和成本高在臨床上較難常規開展。

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massspectrometry，MALDI-TOF MS) 作為興起的一種新的蛋白質組學檢測技術，已廣泛應用于臨床常見細菌的鑒定，其鑒定原理是對微生物的核糖體蛋白組分析，從而形成不同的指紋圖譜，區分微生物。核糖體蛋白提取的質量直接影響質譜鑒定結果，由于分枝桿菌細胞壁堅韌、脂質含量高，不易裂解獲得足量蛋白質，因此標本需要前處理以獲得足量的蛋白質，然而不同的前處理方法會影響到本方法的鑒別能力[2]。應用MALDI-TOF MS檢測分枝桿菌鑒定國內外雖有相關研究報道，但前處理方法多局限固體培養培養[3-4]。現有的液體萃取方法并未獲得高的鑒定率，且步驟繁雜，需要多次處理[5]。此外，由于樣本以及液體介質的潛在干擾，陽性菌量數較低等因素，從液體培養基中準確的鑒定分枝桿菌還是較為困難[6]

本研究旨在通過摸索不同培養時間、處理方法尋找對BACTEC-960液體陽性培養物直接進行MALDI-TOF-MS質譜鑒定的“最優處理方法”，并通過臨床株進行驗證，所有臨床株同時做基因芯片法菌種鑒定做參照進行比對，結果不一致的通過基因測序驗證，評價分枝桿菌液體培養后 MALDI-TOF MS直接鑒定的臨床應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究收集天津市海河醫院2019年1月到2019年12月，MGIT 960分枝桿菌快速液體培養儀機器報陽的陽性培養物，其中420例作為研究對象。

1.2 試劑和儀器 甲酸、乙腈、基質和標準溶劑(美國Bruker Dahonies公司)，MALDI．TOF靶板和Autoflex MALDI．TOF質譜儀(美國Bruker Dahonies公司)，Flexcontrol 3．0軟件和Biotyper 3．0軟件(美國Bruker Dahonics公司),MALDI Sepsityper Kit(美國Bruker Dahonics公司)，超聲震蕩儀，0.5 mm氧化鋯珠(美國BioSpec公司)，L-J 固體培養基(中國BASO 公司)，金屬浴、質譜級純水、無水乙醇，PCR擴增儀、芯片雜交儀和芯片洗干儀(博奧生物有限公司)，微型高速離心機(Eppendorf, 5424)，分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(博奧生物有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 確定最優前處理方法 選擇臨床上萋-尼氏染色陽性的痰標本15份，每份標本同時接種4支BD液體培基，進行BactecTMMGITTM960液體培養，4支樣本分別于“報陽”時，孵育第1 d、第2 d、第3 d，由機器取出(或第1 d報告陽性后置于37 ℃溫箱，到計劃時間取出)，革蘭染色確認有無雜菌進行質譜鑒定，具體操作如下：將BactecTMMGITTM960分枝桿菌快速液體培養系統報陽的標本，利用細菌超聲分散計數儀將分枝桿菌菌分散均勻記錄原管濁度，取1.2 mL培養液到1.5 mL Eppendorf管(孵育1、2、3 d的原管，同樣操作)；離心2 min，轉速13 000 r/min，用移液槍小心吸棄上清液；加入300 μL 去離子水，置100 ℃金屬浴30 min；樣本冷卻后，加入900 μL 75%乙醇，充分混勻；離心2 min，轉速13 000 r/min，用移液槍小心吸棄上清液；沉淀中加入約10 μL的0.1/0.5 mm 氧化鋯珠，視沉淀多少加入15～30 μL的純乙腈(沒過沉淀)，漩渦震蕩2 min或超聲破碎2 min；加入與乙腈體積相同的70%甲酸溶液，渦旋震蕩30 s；13 000 r/min 離心2 min，取上清1 μL 滴加到質譜儀靶板上，并在室溫下自然晾干;在上述樣品點上覆蓋1 μL HCCA 基質溶液，自然晾干后即可上機質譜鑒定。

1.3.2 實驗階段 將420例研究樣本通過預實驗確定的“最優處理方法”后應用MALDI-TOF MS進行鑒定，同時應用DNA微陣列芯片法進行分枝桿菌菌種鑒定。2種鑒定結果不一致的樣本，委托第三方實驗室以基因測序的方法進行確認。基因測序委托天津金唯智生物科技有限公司檢測。

2 結 果

2.1 最優前處理方法試驗結果 對孵育不同時間的15例實驗樣本分別應用0.1 mm、0.5 mm氧化鋯珠、漩渦震蕩/超聲破碎方式進行處理后，進行MALDI-TOF-MS質譜鑒定結果如下：BactecTMMGITTM960系統報陽后，對培養物即刻進行MALDI-TOF-MS鑒定。BactecTMMGITTM960系統報陽后，對培養物繼續孵育1 d、2 d、3 d后，15例標本全部鑒定出來，只是鑒定分值的不同，詳見表1。不同處理方式對比結果，經孵育3 d，使用0.5 mm的氧化鋯珠，超聲震蕩2 min處理后的平均鑒定分值最高，為“最優前處理方法”。

表1 不同前處理方法的MALDI-TOF-MS鑒定分數Tab.1 MALDI-TOF-MS identification scores of different pretreatment methods

2.2 臨床標本鑒定出的分枝桿菌質譜結果及其質譜圖 420例陽性標本分別為結核分枝桿菌復合群290例(69.05%)、偶發分枝桿菌10例(2.38%)、膿腫分枝桿菌28例(6.67%)、胞內分枝桿菌28例(6.67%)、堪薩斯分枝桿菌15例(3.57%)、戈登分枝桿菌4例(0.95%)、龜分枝桿菌6例(1.43%)、蘇爾加分枝桿菌1例(0.24%)、淺黃分枝桿菌9例(2.14%)、馬賽分枝桿菌2例(0.48%)、鳥分枝桿菌17例(4.05%)、摩納哥分枝桿菌2例(0.48%)、免疫分枝桿菌1例(0.24%)、荷斯坦分枝桿菌1例(0.24%)、類戈登分枝桿菌1例(0.24%)、緩黃分枝桿菌1例(0.24%)，譜圖舉例見圖1。

圖1 MALDI-TOF-MS質譜分析圖譜

2.3 MALDI-TOF MS和基因芯片的鑒定結果比對，見表2。

表2 MALDI-TOF MS和基因芯片的鑒定結果比對Tab.2 Comparison of identification results of MALDI-TOF MS and gene chip

2.4 MALDI-TOF MS與基因芯片鑒定成本和鑒定時間的比較 同時采用MALDI-TOF MS與基因芯片對病原菌進行鑒定，記錄2種方法所需要的鑒定時間和鑒定成本，見表3。 MALDI-TOF MS的鑒定時間及鑒定成本均明顯少于基因芯片。對臨床而言，MALDI-TOF MS性價比更高。

表3 MALDI-TOF MS 和基因芯片鑒定成本和耗時比較Tab.3 Comparison of identification cost and time between MALDI-TOF MS and gene chip

3 討 論

應用MALDI-TOF MS直接鑒定BactecTMMGITTM960液體培養出的陽性培養物，筆者認為主要有以下難點：①從液體培基中如何獲得足以進行鑒定的菌量；②如何去除液體培基成分對菌體蛋白的影響；③如何高質量的獲得菌體的核糖體蛋白。

BactecTMMGITTM960自動液體培養檢測系統靈敏度設置的理念是盡可能快地檢測分枝桿菌的生長，因此，系統報陽時液體樣品含有較少的菌量[7]，本研究結果顯示將液體培養的陽性培養物繼續孵育至少1 d，菌量濃度≥0.5麥氏單位時，可獲得可鑒定出的菌量。MGITTM960 液體培養基的主要成分是熒光指示劑(固定在管底)和培養液，培養液包括5.9 g/L改進的肉湯培養基和1.25 g/L的酪蛋白胨，如直接將報陽的液體培養基進行加熱滅活，培養基中的蛋白質成分可能會干擾菌體蛋白的提取，因此我們通過將報陽的液體培基轉移部分培養液至離心管，經過離心處理后取沉淀和質譜級純水洗滌的方式來去除液體培基可能對菌體蛋白的影響。分枝桿菌細胞壁堅韌、脂質含量高，所以要想提取分枝桿菌的核糖體蛋白必須充分破壞其細胞壁，文獻提供的方法一般是增加微型玻璃珠機械研磨及超聲震蕩等物理裂解法，以促進細胞壁堅韌的分枝桿菌屬菌體裂解。但珠子直徑大小，震蕩時間方式文獻各有不同，周昭彥等[8]通過對3種樣本前處理方法的比較。發現直徑0.1 mm氧化鋯/硅膠珠機械震10 min此種前處理方法獲得的質譜圖質量高，優于0.1 mm珠子震蕩3 min和0.5 mm珠子震蕩1 min的方案，楊本善等[9]提供的方案是加入0.1 mm的氧化鋯/硅膠珠，超聲破碎2 min;本研究發現使用直徑0.5 mm的氧化鋯珠配合超聲破碎2 min為最優的破壁方法所得結果最優，結論與上述2位研究者結論不同。

文獻[10-12]顯示質譜對分枝桿菌的鑒定效能差異較大，Cao Yan等[13]在2018年經過嚴格的篩選國外19篇涉及2 593株分枝桿菌分離物應用MALDI-TOF MS鑒定的準確性進行了系統回顧和薈萃分析，利用隨機效應模型的森林圖總結了屬和種水平鑒定的薈萃分析的總體統計結果，臨床分枝桿菌MALDI-TOFMS鑒定的屬級準確率為85%，種級準確率為71%，該研究指出MALDI-TOF MS在臨床致病分枝桿菌鑒定中的應用至今還不太令人滿意，特別是在物種水平上，對改進的需求還是非常重要的。

國內也對質譜鑒定分枝桿菌的效能進行了評價，2016年楊本善等[9]自行設計的“同仁”分枝桿菌液體培養MALDI-TOF MS 直接鑒定法，可將分枝桿菌鑒定至種，準確率高達99.05%。2018年李松等[14]應用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術對55株NTM的鑒定準確率進行評估，鑒定到屬水平為89.1%，種水平為78.2%；2篇文獻鑒定的準確率差異較大,質譜用于分枝桿菌鑒定的實驗數據相當有限，臨床實驗室規模使用的前景還有待評價。本研究通過預實驗確定的“最優處理方法”對臨床株進行處理，得到了較好的鑒定結果，質譜鑒定420份陽性標本中鑒定出419例，其中結核分枝桿菌占69.05%(290/420)，非結核分枝桿菌占30.00%(126/420)，星型奴卡菌占0.48%(2/420)，巴西奴卡菌占0.24%(1/420)，1例未鑒定出，總鑒定率為99.76%。質譜鑒定分值≥2.0的400例占95.23%，分值在1.7～2.0的19例占4.52%，分值<1. 7的1例占0.24%。

基因芯片又稱 DNA或cDNA 微陣列，根據載體探針與帶標記的待測 DNA或 mRNA 雜交產生的信號強弱來判斷靶DNA或mRNA中與芯片相應基因的變異或表達情況，已有分枝桿菌菌種鑒定的商品試劑盒上市，目前可以鑒定結核分枝桿菌和16種臨床常見的NTM[15]。420份陽性標本，基因芯片法鑒定結果為結核分枝桿菌占69.05%(290/420)，非結核菌占28.81% (121/420)，9例未鑒定出，未鑒定占2.14%(9/420)，錯誤鑒定占0.95%(4/420)。

質譜和基因芯片鑒定不一致的菌株本研究采用基因測序予以確認。質譜鑒定分枝桿菌均全部正確鑒定至種(結核分枝桿菌鑒定至復合群水平)。2種方法鑒定不一致的菌株中，36例陽性培養物鑒定為龜-膿分枝桿菌復合群，質譜鑒定結果為28株膿腫分枝桿菌，6株龜分枝桿菌和2株馬賽分枝桿菌，經基因測序與質譜鑒定結果一致。龜分枝桿菌和膿分枝桿菌被認為是在快生長分枝桿菌中人類最具致病性的菌[16],最初兩者被認為是同一物種，直到1992年，分子生物學技術的發展才將其分離成2個不同的物種[17]。雖然龜和膿腫分枝桿菌幾乎具有相同的生物化學特征，但兩者在最佳生長溫度、藥物敏感性、致病性以及它們引起的感染類型、感控等方面存在很大差異。膿腫分枝桿菌的最佳生長溫度為28 ℃～30 ℃，而龜分枝桿菌為35℃～37 ℃。在美國，膿腫分枝桿菌是引起MTN肺病的第3種常見病原菌，占快速生長NTM肺病的80%，此外還與皮膚創傷、術后軟組織感染、中樞神經系統感染等有關[18]。相比之下，龜分枝桿菌僅僅是導致慢性肺病的少見原因，雖在囊性纖維化患者中較常見，但更廣為人知的是引起角膜、皮膚和軟組織感染的原因[19]。感控方面，普遍的共識認為NTM機會性感染具有環境源性，龜分枝桿菌人與人之間的傳播還沒有文獻記載，但膿腫分枝桿菌有人與人傳播的證據[20]。許多實驗室只是簡單地將分離株鑒定到龜膿腫復合群水平。這給患者帶來了風險，因為復合群成員間的抗生素敏感性不同,比如膿腫分枝桿菌對頭孢西丁敏感，而龜分枝桿菌則對頭孢西丁耐藥，克拉霉素均可用于治療龜和膿分枝桿菌的感染，但膿腫分枝桿菌A型攜帶完整的erm基因，更易產生克拉霉素誘導耐藥[21]，因此正確的將兩者區分具有重要的臨床意義。此外，基因芯片技術將馬賽分枝桿菌鑒定為膿腫-龜復合群，馬賽分枝桿菌屬膿腫分枝桿菌復合群，但膿腫分枝桿菌亞種對阿奇霉素和克拉霉素的耐藥性不同，其更易發生克拉霉素耐藥，而馬賽分枝桿菌對這2種藥物的耐藥性無差別，這就可以解釋臨床應用克拉霉素方案治療膿腫分枝桿菌復合群的患者，療效有異質性的現象[22]。不同物種甚至其亞種在致病性、藥物敏感性、治療反應性常常不同，因此快速、準確到種甚至亞種的病原學鑒定對于分枝桿菌的確診及治療具有重要意義。

此外成品的基因芯片商品試劑盒只能鑒定17種分枝桿菌，不在其范圍內的分枝桿菌不能得到鑒定結果，因此對質譜技術檢測出的摩納哥分枝桿菌，免疫分枝桿菌，緩黃分枝桿菌等得出未鑒定或鑒定錯誤的結果，MALDI-TOF MS的分枝桿菌數據庫可鑒定164個種的分枝桿菌，這也提示質譜儀對細菌的準確鑒定率與數據庫的完善與否有很大關系，Couturier[23]的研究也提到儀器數據庫中生物個體單一的參考光譜有時并不能代表分離自其他實驗室的同種典型菌株。為提高MALDI-TOF MS對細菌鑒定能力準確性，我們要考慮菌株來源的地域差異性、標本來源的多樣性和分離時間的不同。自建庫時每一種菌種的特定圖譜也應參考多個同種菌株以保證鑒定結果的準確性，并可通過自建庫的方式擴大數據庫。但MALDI-TOF MS的缺點主要表現為無法鑒定不能被培養的細菌；對混合性細菌的鑒定存在困難；本研究中有1例鑒定法分值低于1.500，系統提示可能為混合性細菌，因此分值較低。

質譜鑒定分枝桿菌的準確性多是與基因測序方法比對，自己設計引物或委托公司測定，均不是臨床實驗室常規應用的項目，而本研究用于比對的是多數臨床實驗室用于分枝桿菌鑒定的成品試劑盒，對質譜鑒定分枝桿菌的臨床推廣更有說服力。與基因芯片的鑒定方法相比，MALDI-TOF MS分析一個樣品大約需要1 min，而整個樣品完成鑒定只需要1～2 h。每個樣品的檢測費用約為5元。如果使用大量的測試樣品，MALDI-TOF質譜鑒定分枝桿菌所需的樣品量小、簡單、快速、準確、廉價。綜上所述，將MALDI-TOF-MS應用于臨床微生物實驗室進行分枝桿菌的常規鑒定是可行的，具有良好的應用前景。