陜西省鼠疫耶爾森菌MLVA分型研究

聶守民，羅波艷，孫養(yǎng)信，范鎖平，常文輝，王宇萌，孫 杰，安翠紅

鼠疫是一種原發(fā)于嚙齒動物之間并能引起人間流行的烈性傳染病，其發(fā)病急、傳染性強、病死率高，在我國是法定的甲類傳染病[1]。在人類歷史上，曾發(fā)生過3次世界大流行，導致數(shù)億人的死亡。在我國歷史上，也曾發(fā)生過數(shù)次流行，嚴重危害了人民生命及經(jīng)濟發(fā)展。鼠疫也是一種自然疫源性疾病，能夠長期在自然界循環(huán)傳播。按照地理景觀、宿主、媒介、鼠疫菌生態(tài)型等特點，將我國的鼠疫自然疫源地劃分為12種類型[2-3]。榆林市定邊縣位于陜西省西北部，是陜西、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古四省(自治區(qū))的交界處。1987年首次被判定為鼠疫自然疫源地，屬于內(nèi)蒙古鄂爾多斯高原長爪沙鼠鼠疫疫源地的一部分。1987-1988年、2000-2001年、2006年分別發(fā)生過3次鼠間鼠疫流行，共分離獲得66株鼠疫耶爾森菌。

鼠疫耶爾森菌是一種多宿主、多媒介的病原體[4]。鼠疫耶爾森菌的分型包括生物型、生態(tài)型及基因型。生物型與生態(tài)型由基因型決定，鼠疫耶爾森菌的分型工作對鼠疫預防控制策略的制定及流行病學研究具有重要的指導意義。目前，常用于鼠疫耶爾森菌基因分型的技術(shù)主要有差異區(qū)段分析(DFR)、規(guī)律成簇的間隔短回文重復序列分析(CRISPR)、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析(MLVA)[5-6]。可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(VNTR)是廣泛存在于微生物基因組中的以相同或相似的核苷酸序列為重復單位的首尾相連序列[7]，同一物種不同個體的VNTR位點重復數(shù)可能不同，這就造成了種內(nèi)的遺傳多態(tài)性。MLVA就是通過組合多個位點的VNTR重復數(shù)來進行個體鑒定的方法[8]，以PCR為技術(shù)基礎(chǔ)，結(jié)合其他分子生物學研究方法來確定VNTR重復數(shù)，從而確定個體的基因型。MLVA主要有分辨能力高、重復性好、操作簡便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于鼠疫疫情暴發(fā)溯源、鼠疫耶爾森菌種群關(guān)系分析。MLVA14+12是最常用的分子分型策略[9]，本研究通過該分型技術(shù)對分離自陜西省鼠疫疫源地的66株鼠疫耶爾森菌進行基因分型研究，建立陜西省鼠疫耶爾森菌的多位點VNTR重復數(shù)數(shù)據(jù)庫，為今后陜西省鼠疫的監(jiān)測防治工作提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株信息 本研究所用的66株鼠疫耶爾森菌均分離自陜西省鼠疫疫源地——榆林市定邊縣。該疫源地分別于1987—1988年、2000—2001年、2006年發(fā)生過3次動物間鼠疫流行。見表1。

表1 陜西省鼠疫耶爾森菌分離株信息Tab.1 Yersinia pestis isolates in Shaanxi Province

1.2 儀器設(shè)備 生物安全柜、生化培養(yǎng)箱、PCR擴增儀、高速離心機、瞬時離心機、水平電泳儀、凝膠成像儀、ABI3730測序儀和移液器。

1.3 試劑耗材 核酸提取試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司)；超純水；2×PCR擴增混合液(2×TSINGKE Master Mix，北京擎科生物科技有限公司西安分公司)；瓊脂糖；5×TBE電泳緩沖液；上樣緩沖液loading buffer；DNA染料；DNA Marker(100 bp Plus DNA Ladder Marker，全式金生物技術(shù)有限公司)；96孔PCR板；EP管；不同規(guī)格槍頭。

1.4 合成引物 參照文獻[9]設(shè)計MLVA(14+12)引物，合成由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成，熒光標記的引物注意避光保存，見表2。

表2 26對引物名稱及序列信息Tab.2 Primer names and sequence information

表2(續(xù))引物上游引物5′端標記熒光序列(5′-3′)目標長度/bpM22-FFAMGCGTGATACCAAAGGCTGGCTCACC235M22-RGGCACTTTGGGTACGGAACGTCATCACM43-FHEXGAGTGCGCGACGGTATGGTGC269M43-RGCCGCGCATTTATTGATGGTGTCM25-FFAMGTTTAGCTGTAAATAGATTTAGAAGCCTCGTCTTTTGAC335M25-RGATATAAATGAGTTGATTCAGGTGTTCATATTTAACGAAACM23-FHEXGTTAAAACTTAATTAACCAACTTAAGAGTCGCCATATC169M23-RGTTATCAGATTTCGCTTGAAGTAGGTTTAACGATGACM28-FFAMGTTTGGCGGTTGGGCGTACCTTGGTA212M28-RAGCGCCCGTAGACGCTTTCGAAATAGCM29-FHEXGAGCGGCGGGTTCTCATGCTGAT233M29-RGTTTAAGCAGTAGATCTAAAGCGTTATGAATATTGGTGTTA

1.5 核酸提取 本研究所用菌株的核酸提取均在青海省地方病預防控制所完成，采用試劑盒法在P3實驗室內(nèi)進行操作。

1.6 擴增體系及參數(shù) 26對引物分成14個反應(yīng)體系，采用雙重或單重PCR方法。單重反應(yīng)體系總體積為25 μL： 2×PCR擴增混合液12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，超純水7.5 μL，DNA模板1 μL。雙重PCR反應(yīng)體系總體積25 μL：10 μmol/L上、下游引物各1 μL，其他用量不變。擴增參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min；60 ℃(退火溫度根據(jù)體系有所不同，需要注意)1 min；72 ℃ 1 min；30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。具體退火溫度見表3。

表3 反應(yīng)體系及各自的退火溫度Tab.3 Reaction system and respective annealing temperatures

1.7 PCR結(jié)果分析 PCR結(jié)束后經(jīng)水平凝膠電泳確定有無產(chǎn)物及非特異性擴增，通過Marker初步確定PCR產(chǎn)物大小。將PCR產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司使用ABI3730測序儀進行毛細管電泳，根據(jù)電泳得到的產(chǎn)物分子量大小來確定各位點重復數(shù)。

1.8 聚類分析 利用BioNumerics(Version7.6)軟件，將前14個位點的權(quán)重設(shè)為2，后12個位點的權(quán)重設(shè)為1。采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進行聚類分析并采用最小生成樹(MST)進行高級聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 26位點VNTR重復數(shù) 陜西省66株鼠疫耶爾森菌分離株基因組中VNTR重復數(shù)結(jié)果見表4。12個位點(MS56、M15、N2117、N2577、N3773、M33、M34、M22、M43、M23、M25、M28)具有2種及以上的重復數(shù)，其他位點只具有1種重復數(shù)。M22位點的分辨力最強，重復種數(shù)最多(7種)。M22、M34、M28、M15、N3773、N2577、M43位點具有較高的遺傳多態(tài)性，MS56、M33、M23、M25、N2117位點遺傳多態(tài)性較低，其他14個位點未出現(xiàn)遺傳變異。

表4 陜西省鼠疫耶爾森菌分離菌株的VNTR位點重復結(jié)果Tab.4 VNTR site repeat results for Yersinia pestis isolates in Shaanxi Province

2.2 MLVA分群結(jié)果 M58、MS56、MS38、M21、M15、M61、MS09、N2486、MS73、MS41、N3779、N2896、N0865、N2976這14個位點是鼠疫耶爾森菌的一級分群指標。陜西省66株鼠疫耶爾森菌分離株經(jīng)BioNumerics聚類分析后被分成3群：A、B、C群，在MS56位點上有8和9兩個重復數(shù)，在M15位點上有6、7和8三個重復數(shù)，其他位點上只有一種重復數(shù)。A群含42株菌，占63.64%，其中只有3株菌為1988年分離，剩余菌株均為2000-2001年分離；B群含16株菌，占24.24%，其中1株菌為1988年分離，剩余菌株均為2006年分離；C群含8株菌，占12.12%，其中2株菌為2000年分離，剩余菌株均為1987-1988年分離。

2.3 MLVA種內(nèi)分型結(jié)果 N1606、N2577、N3773、M34、M33、M22、M43、M25、M23、M28、M29、N2117這12個位點是鼠疫耶爾森菌種內(nèi)分型指標。經(jīng)聚類分析，66株鼠疫耶爾森菌基因型分為19種，命名為1-19型。3型、4型、5型、6型、13型、14型、16型、17型為多菌株基因型，其他型為單菌株基因型。其中4型菌株數(shù)最多，為22株，占菌株總數(shù)的33.33%。1987—1988年分離菌株有7種基因型，2000—2001年分離菌株有12種基因型，2006年分離菌株有2種基因型。有2種基因型(4型、16型)同時出現(xiàn)在1987-1988年、2000-2001年期間。說明鼠疫耶爾森菌基因型發(fā)生了變異，并在流行期間逐漸穩(wěn)定遺傳下來(圖1、圖2)。

圖1 陜西省鼠疫耶爾森菌分離株聚類分析Fig.1 Cluster analysis of Yersinia pestis isolates in Shaanxi Province

圖2 陜西省鼠疫耶爾森菌分離株最小生成樹Fig.2 Minimum spanning tree of Yersinia pestis isolates in Shaanxi Province

3 討 論

歷史上鼠疫曾發(fā)生過3次世界大流行，造成數(shù)億人死亡，給全球經(jīng)濟發(fā)展及社會穩(wěn)定造成沉重打擊。鼠疫是一種自然疫源性疾病，鼠疫耶爾森菌的保存和世代延續(xù)需要具備一種特定的自然生態(tài)系統(tǒng)，稱為自然疫源地。我國是世界上鼠疫自然疫源地分布最廣、結(jié)構(gòu)最為復雜的國家[3]。榆林市定邊縣是陜西省現(xiàn)存的一塊鼠疫自然疫源地，屬于內(nèi)蒙古鄂爾多斯高原長爪沙鼠鼠疫疫源地的一部分。2020年，陜西省鄰省內(nèi)蒙古曾發(fā)生人間鼠疫，其病例密接者進入我省，我省高度重視并協(xié)助處理。加強鼠疫疫源地動物間鼠疫監(jiān)測，防止鼠疫的遠距離傳播是當今鼠疫防控工作的重點。

對引起鼠疫的病原體—鼠疫耶爾森菌進行基因分型是一項很重要的工作，對鼠疫疫情暴發(fā)溯源、鼠疫防控策略制定等都具有重大意義。傳統(tǒng)的分型技術(shù)只能在生物型及生態(tài)型方面進行區(qū)分，而生物型與生態(tài)型是由基因型決定的，所以傳統(tǒng)分型技術(shù)已經(jīng)很難滿足鼠疫防控工作的需求。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因分型技術(shù)應(yīng)用到鼠疫領(lǐng)域。其中應(yīng)用廣泛、效果最好的技術(shù)是MLVA，內(nèi)含多態(tài)性信息，能夠通過組合多個位點的VNTR重復數(shù)來確定個體的基因型。使用MLVA分型技術(shù)，使在區(qū)域或全球各級追蹤鼠疫耶爾森菌種群的傳播途徑成為可能[10]。Li等[9]利用MLVA分型方法建立了我國鼠疫耶爾森菌的基因分型數(shù)據(jù)庫，進一步提升了我國鼠疫防控水平；Li等[11]用MLVA分型技術(shù)分析了中國、中亞和世界其他地區(qū)鼠疫耶爾森菌的關(guān)系，為鼠疫的進化研究提供了一種新視角；Oliveira等[12]用MLVA分型技術(shù)對巴西的鼠疫耶爾森菌進行了研究，結(jié)果表明菌株間存在種內(nèi)遺傳多樣性，菌株的遺傳種群與菌株的地理和時間來源存在一定的相關(guān)性；河北省、云南省、甘肅省等分別采用MLVA分型方法對鼠疫耶爾森菌分離株進行了基因分型，證明了MLVA分型技術(shù)在鼠疫耶爾森菌基因分型方面的良好前景[13-15]。

通過對陜西省分離的66株鼠疫耶爾森菌進行MLVA分型，發(fā)現(xiàn)3次動物鼠疫流行菌株根據(jù)分離時間聚集成為相應(yīng)群，從最小生成樹也可以看出每一次鼠疫流行都有主導基因型鼠疫菌。1987—1988年第一次動物間鼠疫流行，10株菌中有6株分布于C群，3株菌分布于A群，1株菌分布于B群，說明本次流行以C群為主，還有A、B群菌株流行。2000—2001年是第2次流行，41菌鼠疫菌有39株分布在A群中，2株菌分布于C群中，說明本次流行以A群為主，還有C群菌株的流行。2006年的第3次流行，15株菌均分布于B群，說明本次流行鼠疫菌基因型為B群。1987—1988年分離菌株在A、B、C 3個群都有分布，主要在C群，2000—2001年分離菌株在A、C群有分布，主要在A群，2006年分離菌株僅在B群有分布， 3次流行鼠疫菌主導基因型不同，2000—2001年沒有檢測到B群基因型，但在2006年僅檢測到B群基因型，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因還有待于以后進一步分析。66株鼠疫菌生態(tài)型為鄂爾多斯高原生態(tài)型菌株[16]，MLVA基因分型分為3群，19種基因型，A群包含12個基因型，B群包含3個基因型，C群包含4個基因型，群內(nèi)菌株VNTR位點重復數(shù)有細微差別，表明MLVA分型方法分辨率極高，可用于觀察菌株的微遺傳進化。本研究初步建立了陜西省鼠疫耶爾森菌的MLVA基因分型數(shù)據(jù)庫，為今后的鼠疫防控工作提供了科學依據(jù)。