濟南市腹瀉患者沙門氏菌PFGE分子分型及耐藥特征研究

李 娜，劉 輝，李 健，劉 銘，姜慧鈺，陳 瀟，關恒云，劉嵐錚，張京云

沙門氏菌是能引起感染者腹瀉的重要人獸共患病原菌之一，也是引起細菌性食物中毒的主要病原體之一，其分布廣泛且血清型眾多[1]，然而，不同血清型的沙門氏菌的致病性和對抗生素的敏感性不同，因而沙門氏菌的血清分型以及耐藥分析對于臨床治療和研究具有重大意義[2]。脈沖場凝膠電泳(PFGE)是一種研究菌株同源性的有效方法，是國際公認的追蹤溯源的金標準，對于細菌性傳染病的監測及細菌性傳染病疫情暴發的病原識別、追蹤溯源有著非常重要的意義[3]。

近年來，由于抗生素的濫用導致了許多耐藥細菌的產生，甚至出現了多重耐藥細菌或者全耐藥超級細菌，沙門氏菌作為重要的致病菌，其耐藥性不容忽視[4-5]。本研究以濟南市各哨點醫院腹瀉門診患者中分離到的沙門氏菌為研究對象，進行PFGE分子分型和藥敏試驗，為控制沙門氏菌在濟南地區的傳播和進行臨床治療提供相關理論依據，同時為實驗室監測、鑒定溯源及防控預警提供技術支持和數據參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來源 本實驗中90株沙門氏菌均分離自濟南市哨點醫院腹瀉門診患者的糞便標本。脈沖場凝膠電泳分子量標準菌株為沙門氏菌H9812，取自山東省疾病預防控制中心細菌所。藥敏實驗質控菌株ATCC25922購自中國工業微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養基和儀器試劑 沙門氏菌顯色平板購自CHROMagar；營養瓊脂，XLD瓊脂均購自北京陸橋技術股份有限公司；沙門氏菌屬診斷血清購自丹麥國家食品研究所；革蘭氏陰性細菌鑒定卡、VITEK2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統以及比濁儀(bioMerieus Vitek colorimeter)均購自梅里埃生物有限公司；A3A4藥敏板購自上海星佰生物科技有限公司；限制性內切酶XbaⅠ購自TaKaRa公司；蛋白酶K購自MERCK公司；Gelred購自Biotium公司；脈沖場凝膠電泳儀購自BIO-RID公司。

1.2 方 法

1.2.1 沙門氏菌的血清學分型 根據沙門氏菌血清型屬White-Kauffmann Le Minor抗原表,利用玻片凝集法對90株沙門氏菌進行O抗原和H抗原血清凝集試驗確定菌株的血清型別。

1.2.2 PFGE分子分型 參照美國疾病預防控制中心Pulse Net PFGE標準化方法進行[2]，將90株分離的沙門菌株用限制性內切酶XbaⅠ酶切后進行脈沖場凝膠電泳技術(PFGE)，膠塊經Gelred染液染色后成像，再將脈沖場電泳圖譜導入BioNumerics軟件進行聚類分析，構建聚類樹，分析菌株間的相似性。

1.2.3 藥物敏感試驗 利用微量肉湯稀釋法定量測定90株沙門氏菌對以下14種抗生素的藥物敏感性：環丙沙星(CIP)、氨芐西林(AMP)、四環素(TET)、氯霉素(CHL)、復方新諾明(SXT)、頭孢他啶(CAZ)、慶大霉素(GEN)、萘啶酸(NAL)、磺胺異噁唑(Sul)、頭孢吡肟(FEP)、左氧氟沙星(LEV)、多西環素(DOX)、鏈霉素(STR)、亞胺培南(IMI)。根據美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)的相應標準獲得相應敏感(S)、中度敏感(I)和耐藥(R)的結果[2]。

2 結 果

2.1 沙門氏菌血清分型 對90株沙門氏菌進行血清學鑒定，共鑒定出27個血清型，主要為鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌，分別為43株和16株。

表1(續)血清型抗原式菌株數占比/%姆班達卡沙門氏菌6,7:z10:e,n,z1511.11斯坦利沙門氏菌4,5,12:d:1,211.11奧拉寧堡沙門氏菌6,7:m,t:-11.11雛生化沙門氏菌9,12:-:-11.11特西翁闊沙門氏菌6,8:e,h:e,n,z1511.11門登沙門氏菌6,7:z10:1,222.22科羅拉多沙門氏菌6,7:l,w:1,511.11金斯敦沙門氏菌4,12:g,s,t:-11.11丘古沙門氏菌6,7:z10:e,n,x11.11福爾斯布特爾沙門氏菌3,10:l,v:z611.11

2.2 脈沖場凝膠電泳及聚類分析 將90株分離的沙門菌株用限制性內切酶XbaⅠ酶切后進行脈沖場凝膠電泳技術(PFGE)，膠塊經Gelred染液染色后成像，90株沙門氏菌帶型相似度在49%～100%(圖1)。同一血清型沙門氏菌大部分菌株PFGE圖譜可聚集成簇，但腸炎沙門氏菌與都柏林沙門氏菌PFGE圖譜相似度較高，2種血清型菌株部分聚集成簇存在(圖1)。

圖1 90株沙門氏菌PFGE聚類分析圖譜Fig.1 PFGE analysis of 90 Salmonella isolates

2.3 藥敏試驗結果 通過肉湯稀釋法隨機抽取40株沙門氏菌做藥物敏感試驗，結果顯示其對氨芐西林耐藥率最高，其次是萘啶酸、磺胺異噁唑、四環素、多西環素和鏈霉素，對頭孢類抗生素較為敏感，對亞胺培南最敏感，敏感率為100%(表2)。

表2 40株沙門氏菌對14種抗生素的耐藥情況Tab.2 Resistance of 40 Salmonella isolates to 14 antibiotics

40株沙門氏菌中只有8株對14種抗生素完全敏感，其余32株菌都有不同程度耐藥(表3)。

表3 40株沙門氏菌耐藥譜Tab.3 Drug-resistance spectrum of 40 strains of Salmonella

3 討 論

感染性腹瀉一直是重要的公共衛生問題，也是發展中國家常見的一種傳染病[6-7]，每年約有6億人發病，其中沙門氏菌是引起感染性性腹瀉最常見的致病菌[7]，也是濟南地區引起食物中毒的主要病原菌之一，沙門氏菌菌型繁多，迄今已發現2 500多個血清型[8]。本次研究中濟南市共鑒定出27個血清型，主要優勢血清型別為鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌，這與國際及國內其他研究結果一致[1-2,7,9-11]，特別是鼠傷寒沙門氏菌[12]，已成為濟南地區最常見的血清型；不同的是濟南地區的沙門氏菌血清型更復雜多樣，且近年來頻繁發生一些由罕見血清型引起的腹瀉病例或者食物中毒事件[13]；且不同血清型沙門氏菌的致病性、臨床表現以及流行病學特征值得我們進一步深入研究。

沙門菌污染食品致腹瀉暴發由以前的點源性集中暴發，越來越多地轉變為跨地區跨州(省)的散在暴發形式出現，使污染源及傳播途徑的發現存在一定難度[14]。目前，單純的沙門氏菌血清分型鑒定已經滿足不了復雜的食源性疾病診斷及對病原體進行溯源分析的需求，脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)是20世紀80年代中期發展起來一種非常有效的分子分型的方法，被譽為細菌分子生物學分型技術的“金標準”[15-17]。本研究中的PFGE分子分型結果顯示，濟南地區沙門氏菌帶型多樣具有多態性，以鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的帶型最為集中，且無地域和時間的聚集性，說明近年來濟南市無沙門氏菌既往暴發，但由于分離菌株數量較少，尚需不斷擴大監測范圍，不斷建立并完善沙門氏菌PFGE分型數據庫，為下一步為實驗室監測、鑒定溯源及防控預警提供技術支持和數據參考。

近年來，由于抗生素的濫用導致了許多耐藥細菌的產生[18]，甚至出現了多重耐藥細菌或者全耐藥超級細菌，從而使越來越多的患者對抗生素產生耐藥[12,19-21]。感染患者的高病死率和缺乏有效抗感染藥物的現狀對臨床治療提出了挑戰。本研究結果顯示只有20%的菌株對14種抗生素完全敏感，其余80%的菌株都有不同程度的耐藥，對氨芐西林耐藥率高達72.55%，其次是萘啶酸、磺胺異噁唑、四環素、多西環素和鏈霉素，耐藥率分別為65%、60%、55%、47.50%和55%。另外，沙門氏菌多重耐藥現象非常明顯，多重耐藥率達67.50%，與聊城地區、上海地區及云南省等多地區多重耐藥率相差不大[2,4,7,9,12,14]，但濟南地區的多重耐藥程度卻是最嚴重的，從耐藥譜來看40株菌共產生21個耐藥譜，優勢耐藥譜為AMP+TET+NAL+Sul+DOX+STR，藥物種類達到6種，相對其他省市來看，濟南市耐藥形式更為嚴重，其中耐4種及以上抗生素的有25株，占62.50%(表3)，約半數菌株對6種及以上抗生素產生耐藥，2株鼠傷寒沙門氏菌和1株病牛沙門氏菌對9種抗生素產生耐藥，還有1株印第安納沙門氏菌對13種抗生素耐藥，這是在國內沙門氏菌研究中非常罕見的，這些提示濟南市沙門氏菌的耐藥形勢非常嚴峻，對耐藥結果應進行深入的流行病學調查及分子生物學研究，以了解沙門氏菌菌株多重耐藥原因，為解決沙門氏菌的耐藥問題提供科學依據。

總之，本研究初步建立了濟南市腹瀉人群腸道沙門氏菌PFGE分子分型數據庫，為今后的流行病學溯源及防控預警奠定了基礎。與此同時，濟南地區沙門氏菌的耐藥現象不容忽視，且不同血清型的沙門氏菌耐藥譜不同，臨床應合理規范使用抗生素并加強耐藥監測。另外，疾控部門、醫院和食藥監部門應加強合作，加大對食品的檢測力度及并規范抗生素的合理使用，為食源性疾病的防治提供堅強后盾。