2019—2020年山東省H3N2流感病毒抗原性及血凝素基因特征分析

吳巨龍，呂 健，寇增強，宋紹霞，孫 林，何玉潔，劉 倜

流行性感冒是人類最常見的上呼吸道感染性疾病之一，由流感病毒引起。流感病毒根據其核蛋白和膜蛋白的抗原特性不同可以分為甲、乙、丙3型流感病毒。目前，甲型流感病毒根據其表面的血凝素(HA)抗原的不同可分為18個亞型，根據神經氨酸酶(NA)抗原的不同可以分為11個亞型[1]。H3N2流感病毒于1968年開始在人類中傳播以來，一直是季節性流感流行的1個主要亞型，季節性H3N2流感具有潛伏期短且傳播速度快的流行特點，并且主要在人際間傳播，全年各個季節都會發生感染病例，且每隔3～8年便會出現新的抗原漂變株[2]。血凝素(HA)作為流感病毒的重要抗原，可以與細胞表面病毒特異性受體結合并且刺激機體產生中和抗體[3]。病毒的抗原位點和受體結合位點均位于HA上[4]，因此對HA的變異研究尤為重要。本研究擬通過對2019—2020年流感監測年度山東省分離株流感病毒進行抗原性及HA基因特性分析，了解該亞型毒株的變異趨勢，為流感的預防和控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 毒株收集 依據國家流感中心規定，每年4月1日所在周至次年4月1日所在周前一周為一個流感監測年度，因此2019—2020年流感監測年度的采樣日期為2019年4月1日至2020年3月29日。采集此期間山東省各國家級哨點醫院流感樣病例標本，采用犬腎細胞(MDCK)進行流感病毒分離。所有毒株均經過山東省疾控中心復核鑒定后用于本研究分析。我們將此期間收檢的甲型H3N2流感病毒根據病毒的采樣日期和分離地點隨機選取40株病毒用于抗原性分析，并對其中19株病毒進行測序。

1.2 流感病毒的抗原分析 標準參考抗原為WHO推薦的2019—2020年北半球疫苗株A/Kansas/14/2017，其免疫雪貂后的抗血清作為標準參考血清。標準參考抗原及標準參考血清均由中國疾控中心提供。利用紅細胞凝集抑制實驗(Hemagglutination inhibition, HI)進行抗原性分析，紅細胞采用人“O”型血離心洗滌制備，具體方法按照《全國流感監測技術指南》(2017版)。

1.3 序列測定 RT-PCR擴增核酸提取使用西安天隆科技有限公司生產的核酸提取試劑盒(Lot 20042110T025)；基因擴增使用Invitrogen公司的One Step RT-PCR Kit試劑盒，擴增引物序列來自國家流感中心，引物合成由上海Invitrogen完成。擴增產物送上海伯杰生物有限公司進行雙向測定。

1.4 序列分析 序列拼接使用Velvet、Bowtie2和Sam tools軟件。序列比對使用MEGA.6軟件的Clustal W方法，采用Neighbor-Joining方法構建種系進化樹。通過NetNGlyc 1.0 Server糖基化位點預測網站對潛在糖基化位點進行在線預測分析。本研究從全球共享流感數據倡議組織GISAID網站下載WHO2014年以來推薦的甲型H3N2亞型流感北半球疫苗株HA序列作為進化樹構建骨架，包括A/Texas/50/2012(2014—2015年疫苗株)、A/Switzerland/9715293/2013(2015—2016年疫苗株)、A/Hong Kong/4801/2014(2016—2018年疫苗株)、A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(2018—2019年疫苗株)、A/Kansas/14/2017(2019—2020年疫苗株)、A/Hong Kong/2671/2019(2020—2021年疫苗株)。

2 結 果

2.1 抗原性分析 本次實驗參考抗原A/Kansas/14/2017與參考血清自身HI效價為1∶160。所選的40株H3N2毒株與參考血清的HI效價為1∶20的有26株，其余14株中有9株HI效價為1∶40，5株HI效價為1∶80。根據WHO判斷標準，當待檢病毒與參考血清的HI效價低于參考抗原與參考血清自身HI效價的8倍(含8倍)或以上時，則認為待檢病毒為該參考血清檢測到的低反應株；反之，當相差8倍以內時(不含8倍)，則認為待檢病毒與參考抗原的抗原性類似，為類似株。按照上述判斷標準，本次實驗所選的40株H3N2毒株與參考株相比，35%(14/40)為A/Kansas/14/2017的類似株，其余65%(26/40)為A/Kansas/14/2017的低反應株。

2.2 HA基因同源性分析 用MegAlign軟件對研究分離的19株H3N2亞型流感毒株的HA基因核苷酸序列進行同源性分析，結果顯示19株分離株HA核苷酸同源性為99.11%～100.0%，氨基酸同源性為98.93%～100.0%。將待檢毒株與疫苗株HA基因序列比對，進行同源性分析。結果顯示，2019—2020年山東省流感監測年度分離的H3N2流感毒株與當年推薦的疫苗株A/Kansas/14/2017之間的同源性相對與其他年份疫苗株的同源性較低。待檢毒株與疫苗株之間核苷酸、氨基酸同源性分析及核苷酸遺傳距離結果，見表1。從系統進化樹可以看出，19株分離株與當季疫苗株A/Kansas/14/2017在進化樹上的距離較遠，而與2020—2021年疫苗株A/Hong Kong/2671/2019關系最近，且聚為一個支，全部屬于3C.2a1b分支，見圖1。

表1 19株H3N2亞型流感病毒流行株與疫苗株之間的HA基因同源性分析Tab.1 Homology analysis of the HA gene among 19 H3N2 subtype influenza virus epidemic strains and vaccine strains

▲：WHO推薦的2019-2020年疫苗株；●:WHO推薦的2020-2021年疫苗株；■：WHO之前推薦的疫苗株圖1 2019-2020年山東省測序H3N2流感毒株HA基因進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the HA genes of H3N2 influenza strains sequenced in Shandong Province from 2019 to 2020

2.3 HA基因氨基酸位點變異分析 H3N2亞型流感病毒HA1蛋白共有A、B、C、D和E 5個抗原決定簇。與疫苗株A/Kansas/14/2017相比較，參與分析的19株流行株均發生了抗原決定簇位點氨基酸替換，涉及4個抗原決定簇，其替換特征與疫苗株A/Hong Kong/2671/2019有相似，也有不同。所有的19株病毒在A區135位、137位、144位，B區159位、160位均不同于疫苗株A/Kansas/14/2017。此外在A區140位有2株，B區158位、198位各1株，C區53位有4株，D區207位有1株毒株有抗原決定簇位點發生突變。值得注意的是監測毒株A區135位、137位、144位，B區159位與最新疫苗株A/Hong Kong/2671/2019一致。E區未監測到變異發生。見表2。流感病毒受體結合位點位于HA1蛋白，由左壁(225～228位)、右壁(155位)、前壁(130～137位)、后壁(183位、190位、194位)和底壁(98位、153位)組成[5]。與當年疫苗推薦株A/Kansas/14/2017相比較，2019—2020年山東省H3N2流感病毒受體結合位點變異主要發生在前壁，所有毒株均出現T135K，S137F變異。

表2 2019-2020年山東省H3N2亞型流感毒株HA基因抗原性位點變異Tab.2 Antigenic variants in the HA gene of influenza A viruses (H3N2) in Shandong Province, 2019-2020

表2(續)毒株名稱抗原決定簇ABCD13513714014415815916019853207A/Shandong-Bincheng/3250/2019KFISNYTSNKA/Shandong-Zichuan/330/2019KFISNYTSDKA/Shandong-Taishan/385/2019(H3)KFISNYTSDRA/Shandong-Dongying/1661/2019(H3)KFISNYTSNKA/Shandong-Donge/38/2019(H3)KFISNYTSNKA/Shandong-Rencheng/122/2020(H3)KFISNYTSDKA/Shandong-Yanzhou/339/2019(H3)KFISNYTSDKA/Shandong-Laiwu/324/2020(H3)KFMSNYTSDKA/Shandong-Mudan/1855/2019(H3)KFISNYTSNKA/Shandong-Zichuan/362/2019(H3)KFMSNYTSDKA/Shandong-Dongchangfu/1719/2019(H3)KFISNYTSDKA/Shandong-Zhifu/18/2020(H3)KFISNYTPDKA/Shandong-Shizhong/1887/2019(H3)KFISNYTSDKA/Shandong-Dongying/1672/2020(H3)KFISNYTSDKA/HongKong/2671/2019KFISNYISDK

2.4 糖基化位點分析 血凝素蛋白的糖基化位點增加或減少對流感病毒的抗原性及其他生物學特性均有一定影響。疫苗株A/Kansas/14/2017血凝素蛋白共有11個潛在糖基化位點，分別位于第8、22、38、45、63、122、133、165、246、285、483位。與疫苗株A/Kansas/14/2017相比，所有19株毒株在133位有糖基化位點缺失，但有17株毒株在158位點增加了糖基化位點。最新疫苗株A/Hong Kong/2671/2019在133和158位點都沒有潛在糖基化位點。見表3。

表3 2019-2020年山東省H3N2亞型流感毒株HA糖基化位點變異情況Tab.3 Amino acid substitutions in HA gene glycosylation sites of influenza A viruses (H3N2) in Shandong Province, 2019-2020

表3(續)毒株名稱8(NST)22(NGT)38(NAT)45(NSS)63(NCT)122(NES)133(NGT)158(NYT)165(NVT)246(NST)285(NGS)483(NGT)A/Shandong-Rencheng/122/2020??????-?????A/Shandong-Yanzhou/339/2019??????-?????A/Shandong-Laiwu/324/2020??????-?????A/Shandong-Mudan/1855/2019??????-?????A/Shandong-Zichuan/362/2019??????-?????A/Shandong-Dongchangfu/1719/2019??????-?????A/Shandong-Zhifu/18/2020??????-?????A/Shandong-Shizhong/1887/2019??????-?????A/Shandong-Dongying/1672/2020??????-?????A/HongKong/2671/2019??????--????

3 討 論

流感病毒在免疫選擇壓力下，通過HA和NA的堿基置換發生抗原進化，極易變異而引起不同程度的流行[6]。有研究表明，H3N2抗原的長期變異速率，比其他亞型流感病毒進化速率更快[7]。這使得季節性H3N2流感病毒更易引起局部的流行暴發，對易感人群的危害也更大。疫苗主要是通過誘導機體產生中和抗體起到對流感病毒的預防作用，但流感病毒可通過抗原漂移和抗原轉換來對抗宿主的免疫反應，流感病毒的頻繁變異導致WHO并不是每次都能準確預測疫苗株[8]。若是流感疫苗株對各亞型內抗原匹配較好，則產生較好的保護作用，對匹配程度較差的毒株保護效果則有限。不同地區流感疫苗免疫效果的研究結果顯示，對于不匹配毒株，流感疫苗的保護作用普遍較差[9]。

自2009年以來，世界衛生組織全球流感監測網絡根據HA基因序列將甲型流感H3N2病毒確定為7個基因組。近年來的研究表明，第3基因組H3N2流感病毒已占主導地位，并已形成亞群[10]。在本次研究中，隨機選擇的本地季節性H3N2流行毒株均為3C組，是目前全球流行的主要支系。3C組分為3C.1、3C.2、3C.3 3個亞組，它們在抗原性上總體是相似的，但有差異[10-11]。日本2014-2015年流感季，就是由于主要流行的是3C.2a基因型H3N2病毒，而疫苗株卻是3C.1基因型，進而導致疫苗作用降低[12]。在2017年，3C.2a 基因亞群中又出現了進一步變異的集群[13]，與一些國家的疫苗免疫失敗案例有關[9,14]。

本研究分析了2019年4月至2020年3月間山東省H3N2亞型流感病毒抗原性及血凝素基因特征，通過抗原性分析，發現僅35%的毒株為疫苗株類似株。這或許與此期間流行的H3N2流感病毒均是屬于3C.2a亞群，而疫苗株屬于3C.3a有關。通過序列比對還發現，本次實驗所有入選監測毒株的HA抗原與疫苗株相比較均出現了5處抗原表位的變異，2處位于前壁的受體結合位點氨基酸發生變異。通常認為，如果抗原決定簇中的4個以上位點發生突變，且這些位點分布在2個以上的抗原決定簇上時，表明新的抗原漂變株出現[15]，這時疫苗株的接種就可能會失去對流行株的保護。此外，血凝素蛋白糖基化位點可以穩定蛋白結構，其數目的增減會影響中和抗體與HA抗原表位的結合，從而使病毒逃避宿主免疫識別，進而影響病毒的抗原性、傳染性和致病性[16]。本研究中所有毒株與2019—2020年疫苗株相比發生1處糖基化位點缺失(19/19)，1處糖基化位點增加(17/19)，這也提示我們還要進一步對甲型H3N2流感病毒流行株與疫苗株的抗體進行有效的評價。

本研究發現，2019—2020年山東省甲型H3N2流感流行株與疫苗株在抗原表位、受體結合位點及糖基化位點等存在差異，提示2019—2020年山東省H3N2亞型流感病毒抗原性可能發生了轉變，同時WHO推薦的2019—2020年北半球疫苗株保護性可能不太理想。本研究從分子水平提高了流感監測的敏感性，及時對山東省甲型H3N2流感病毒HA基因的變異情況進行監測，可為疫苗株的篩選提供參考，同時也為今后山東省的流感防控和分子生物學監測提供依據。