昆山地區(qū)鱸魚維氏氣單胞菌的分離鑒定及組織病理學(xué)觀察

岳蒙蒙，李 微，蔣 明，潘云生

(昆山市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 昆山 215300)

一、病害檢測總體情況

2020年8月，昆山某養(yǎng)殖場發(fā)現(xiàn)部分鱸魚體表潰爛、鱗片脫落等現(xiàn)象，臨床特征表現(xiàn)為病魚活動(dòng)遲緩、攝食減少或不攝食、體側(cè)或背部潰瘍、鰓絲充血或出血。為明確病因，筆者對(duì)患病鱸魚進(jìn)行了病原菌分離鑒定，根據(jù)菌株形態(tài)、生理生化特征、16s RNA 序列分析，發(fā)現(xiàn)是維氏氣單胞菌，并通過觀察組織病理變化，以供從業(yè)者參考。

二、病原菌分離鑒定及病理組織切片

1.主要材料

患病鱸魚規(guī)格180 克/尾左右，健康鱸魚規(guī)格150 克/尾左右，均采自昆山某養(yǎng)殖場。LB 培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯均購自上海生工生物試劑有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)全市5個(gè)病害測報(bào)點(diǎn)發(fā)病鱸魚樣品進(jìn)行致病菌分離，每次采取3 尾患病鱸魚樣品，解剖病魚，觀察各組織器官病理損傷情況。取腎、肝、鰓、腸組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定48 小時(shí)，脫水、透明、石蠟包埋后HE 染色，中性樹膠封片，切片厚度5～6毫米，Olympus BX41顯微鏡下觀察并拍照。

在無菌條件下，從患病魚的腎、肝、鰓、腸組織取樣，劃線接種至LB 平板培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，觀察菌落生長形態(tài)。

取新鮮菌液送至上海生工生物有限公司進(jìn)行一代測序，使用的通用引物序列為27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。將獲取菌株的16s RNA 序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)。

三、結(jié)果與分析

本次實(shí)驗(yàn)中，挑取的菌株表面光滑、中央凸起，經(jīng)革蘭氏染色，分離菌株為革蘭氏陰性菌。

維氏氣單胞菌的鑒定方法通常需要在生理生化鑒定的基礎(chǔ)上進(jìn)行16s RNA序列分析鑒定。經(jīng)生理生化鑒定與16s RNA序列分析結(jié)果，確定昆山市5個(gè)病害測報(bào)樣點(diǎn)的病原菌為維氏氣單胞菌。維氏氣單胞菌具有強(qiáng)致病性，但其感染不同水生動(dòng)物表現(xiàn)均不相同(董忠典等，2012)。人食用了維氏氣單胞菌污染的水產(chǎn)品后，可引起腸胃炎和敗血癥等，免疫力低下者甚至可能出現(xiàn)死亡(陳言峰等，2011；張慶華等，2016)。

維氏氣單胞菌主要引起鱸魚出血、腹水、眼球突出、腸炎等癥狀，患病鱸魚有明顯表層出血現(xiàn)象，體表出現(xiàn)潰瘍?cè)睢⒏癄€(圖1)。肌肉潰爛給鱸魚的行動(dòng)造成不便，影響攝食，并且潰爛處的肌肉有可能給其他病原微生物提供適宜的生存環(huán)境，從而會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的感染(耿昕穎等，2016)。本研究對(duì)維氏氣單胞菌引起的鱸魚病理組織進(jìn)行觀察，同時(shí)發(fā)現(xiàn)鰓絲腫脹出血，鰓小片結(jié)構(gòu)腫脹充血(圖2)；肝細(xì)胞間隙增寬，出現(xiàn)溶解壞死，并未出現(xiàn)明顯的水腫或萎縮等病理特征，顯微鏡下可見部分病變肝細(xì)胞呈空泡樣變性，肝細(xì)胞分泌功能受損(圖3)。腸道黏液增加，腸絨毛部分壞死脫落(圖4)。腎組織沒有明顯病變(圖5)。水體中的嗜水氣單胞菌廣泛存在，其繁殖速度以夏秋兩季最快，在水質(zhì)惡化、水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體損傷或免疫力降低時(shí)能引起很高死亡率(左躍等，2013；柏愛旭等，2018)。近年來關(guān)于嗜水氣單胞菌的報(bào)道越來越多，該菌菌株毒力有強(qiáng)弱之分，其中強(qiáng)毒菌株具有較強(qiáng)的致病性，常造成水生動(dòng)物急性、暴發(fā)性死亡(于學(xué)輝等，2007)。

圖1 實(shí)驗(yàn)用鱸魚(左為患病鱸魚，右為健康鱸魚)

圖2 鰓組織切片(左為患病鱸魚，右為健康鱸魚)

圖3 肝組織切片(左為患病鱸魚，右為健康鱸魚)

圖4 腸組織切片(左為患病鱸魚，右為健康鱸魚)

圖5 腎組織切片(左為患病鱸魚，右為健康鱸魚)

昆山地區(qū)維氏氣單胞菌感染鱸魚病變主要表現(xiàn)為體表潰瘍，肝臟、腎臟腫大。針對(duì)昆山地區(qū)鱸魚養(yǎng)殖情況，未來將重點(diǎn)研究維氏氣單胞菌的防治方法。中草藥及疫苗的使用可極大減少菌株的抗藥性和水體的進(jìn)一步惡化，近年來，基于中藥和益生菌等新型抗生素替代品的疾病防控技術(shù)研究已取得顯著進(jìn)展。本次研究未進(jìn)行藥敏測試，菌株耐藥性還有待于進(jìn)一步研究。