基于COI和16S rRNA基因片段鑒定廈門海域的仔稚魚

徐春燕，莊之棟，馬 超，劉 勇，沈長春，蔡建堤，謝少卿

(福建省水產研究所，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

魚類早期個體(包括魚卵、仔稚魚)發育過程是魚類生命周期中非常短暫、形態學和生理學等特征變化明顯的過渡時期[1]，魚卵和仔稚魚調查研究是魚類生態學以及魚類生活史研究的一部分，同時也是魚類資源調查、早期補充機制和種群數量變動、漁業資源可持續利用等研究的重要基礎[1-2]。目前，魚卵和仔稚魚種類的鑒定多是根據形態特征進行區別，但由于個體較小、用于鑒別的形態特征較少，不同種類很難進行準確區分。與已知的成魚種類相比，已鑒別的魚卵和仔稚魚種類少之又少，魚類早期生活史的相關研究相對滯后，相關形態學資料和圖集十分有限，嚴重限制了鑒定工作的開展；另外國內缺少相關的分類學家，鑒定者的水平不一，很難保證鑒定結果的準確性[3-5]。

2003年，加拿大分類學家Hebert P D N[6]首次提出DNA條形碼的概念，此后，DNA條形碼技術被廣泛應用于各種動物、植物及海洋生物的種類鑒定[7-9]。DNA條形碼技術利用DNA序列對物種進行鑒定，突破了傳統分類學只能依靠外部形態特征鑒定物種的限制，對產卵場相互交疊和產卵期相互交錯、形態特征近似、形態學分類困難的魚類早期個體種類的分類以及形態學分類上存有疑問的種類的驗證提供了新的方法和手段[1]。線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(Cytochrome C oxidase subunit I，COI)基因是魚類常用的條形碼基因，被廣泛應用于物種鑒定和多樣性分析[7，10-12]。然而，目前有研究指出單一的COI基因并不適用于所有魚類物種的鑒別[13]，結合其他條形碼基因相互參照和驗證是確保條形碼技術鑒定準確性的必要手段[7，14-15]。

本研究選取應用比較廣泛的COI和16S rRNA基因，對廈門海域采集的仔稚魚樣品進行種類鑒定，通過分析遺傳距離及系統進化關系，探究其在仔稚魚種類鑒定中的適用性，同時可以為仔稚魚的準確鑒定和分類學研究提供依據和基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與形態學鑒定

在廈門海域設置12個采樣站位(圖1)，分別于2019年4月22日和2020年9月14日采集仔稚魚樣品。參照GB/T 12763.6—2007《海洋調查規范 第6部分：海洋生物調查》[16]，利用大型浮游生物網(網口內徑80 cm，網長280 cm，孔徑0.505 mm)進行水平拖網采樣，樣品用95%酒精現場固定，帶回實驗室進行形態學和分子生物學鑒定。

采集到的仔稚魚樣品首先在奧林巴斯SZX7體視顯微鏡下根據形態特征進行鑒定和形態學歸類，參照Okiyama M的《An Atlas of the Early Stage Fishes in Japan》[17]及張仁齋等的《中國近海魚卵與仔魚》[2]進行鑒定，之后根據初步的鑒定結果，每一種選取代表性個體進行基于COI和16S rRNA基因的DNA條形碼分析。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

選取的仔稚魚樣品用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒進行DNA提取，DNA樣品置于4℃保存備用。COI基因序列擴增采用通用引物[18]，Fish F1：5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′，Fish R1：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′；16S rRNA基因序列擴增采用通用引物[19]，16S AR：5′-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′，16S BR：5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′。

PCR反應體系：2.5 μL 10×buffer，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，正反引物(10 μmol/L)各1 μL ，0.2 μL Taq酶，DNA模板1 μL，超純水補足至25 μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性60 s，50℃退火50 s，72℃延伸60 s，30個循環；最后72℃延伸5 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，選取擴增效果好的PCR產物送至上海生工進行雙向測序。

1.3 序列分析

測序獲得的序列首先利用Chromas 2.6.5軟件查看原始序列質量，質量好的序列利用Seqman軟件進行雙向拼接。將拼接所得COI和16S rRNA基因序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)網站進行比對，COI基因同時可以在BOLD(Barcode of Life Database)進行比對。比對后分別根據相似度進行種類鑒定，與庫中物種序列相似度≥99%的即鑒定為同一個種，92%～99%之間的鑒定為同一屬，85%～92%之間的鑒定為同一科[4]，另外，兩種基因鑒定結果一致時，最終將此種鑒定為一個物種，結果不一致時，則將其鑒定到科或屬。鑒定后相關序列及信息遞交至GenBank獲取序列號。兩種基因分別用MEGAX軟件中Clustal W程序進行多重比對，比對后去除兩端冗余序列，保留共有序列區域進行后續分析，統計序列的長度、堿基組成、保守位點、變異位點、簡約信息位點、單突變位點，種內和種間遺傳距離基于Kimura-2-parameter雙參數模型(K2P)進行計算，分子系統進化樹利用鄰接法(Neighbor-joining)構建，以Bootstrap 1 000次重復抽樣檢驗其分支置信度[20]。

2 結果與分析

2.1 測序結果及序列分析

本研究共選取80尾仔稚魚樣品分別進行COI和16S rRNA基因的條形碼分析，由于在DNA提取、PCR擴增及測序過程中，均有可能出現結果不佳的情況，最終獲得64條COI基因序列和74條16S rRNA基因序列。COI基因序列平均長度655 bp，16S rRNA基因序列平均長度575 bp，序列均遞交至GenBank獲取序列號，序列號見表1。

COI基因序列的平均堿基組成為T：30.4%、C：28.0%、A：23.4%、G：18.2%，A+T含量(53.8%)高于G+C含量(46.2%)，符合多數魚類COI序列的堿基組成特征。各密碼子堿基組成表現出明顯的差異性，第2個密碼子平均GC含量最高，為56.5%；第3密碼子次之，平均為42.7%；第1密碼子平均GC含量最低，為39.5%。全部位點中包括保守位點379個、變異位點276個、簡約信息位點265個、單突變位點11個。

16S rRNA基因序列的平均堿基組成為T：22.9%、C：25.4%、A：28.6%、G：23.1%，A+T含量(51.5%)高于G+C含量(48.5%)，與多數魚類線粒體DNA的堿基組成特征一致。各密碼子堿基組成表現出明顯的差異性，第1個密碼子平均GC含量最高，為54.8%；第3密碼子次之，平均為45.7%；第2密碼子平均GC含量最低，為44.9%。全部位點中包括保守位點301個、變異位點298個、簡約信息位點278個、單突變位點20個。

2.2 序列比對及仔稚魚種類鑒定

所得COI基因同時在NCBI和BOLD數據庫進行比對，16S rRNA基因在NCBI比對，比對后依據相似度進行鑒定，鑒定結果見表1。COI基因將仔稚魚樣品鑒定為26個種類，其中19個種類鑒定到種、6個鑒定到屬、1個種類僅鑒定到科；16S rRNA基因將仔稚魚樣品鑒定為29個種類，其中23個種類鑒定到種、6個鑒定到屬。

表1 基于COI和16S rRNA基因鑒定的廈門海域仔稚魚

兩種基因鑒定結果基本一致，僅有三處存在分歧。COI基因鑒定為鯡形目sp.(Clupeiformes sp.)的種類，在NCBI和BOLD中與潔白鯡(Escualosathoracata)和印度小公魚(Stolephorusindicus)相似性均≥99%，不能確定具體為哪一個種類，僅將其鑒定到鯡形目sp.；而NCBI數據庫中沒有印度小公魚16S rRNA基因，所以此種16S rRNA基因的比對結果僅與潔白鯡相似性≥99%，將其鑒定為潔白鯡；兩種基因比對鑒定結果不同，本研究僅將其鑒定為鯡形目sp.。COI基因鑒定為小沙丁魚屬sp.(Sardinellasp.)的種類， 在NCBI和BOLD中與黑尾小沙丁魚(S.melanura)、 白腹小沙丁魚(S.albella)、 纟遂鱗小沙丁魚(S.fimbriata)和多耙小沙丁魚(S.jussieui)相似性均大于99%， 無法確定為哪一個種類， 僅鑒定到小沙丁魚屬sp.； 而其16S rRNA基因僅與纟遂鱗小沙丁魚相似性大于99%， 其余小沙丁魚屬種類相似性均低于99%， 將其鑒定為纟遂鱗小沙丁魚；本研究將其鑒定為小沙丁魚屬sp.。 COI基因鑒定為小公魚屬sp.(Stolephorussp.)的種類， 在NCBI和BOLD中與短背小公魚(S.bataviensis)和江口小公魚(S.commersonnii)相似性均大于99%， 無法確定為哪一個種類， 僅鑒定到小公魚屬sp.； NCBI數據庫中沒有江口小公魚16S rRNA基因， 所以此種16S rRNA基因的比對結果僅與短背小公魚相似性≥99%， 將其鑒定為短背小公魚； 本研究將其鑒定為小公魚屬sp.。

續表1

2.3 遺傳距離

利用MEGAX軟件，基于K2P模型計算各分類階元的遺傳距離，結果見表2。

各種類COI基因的種內遺傳距離在0～0.005 4之間，平均種內遺傳距離為0.001 5(SD=0.001 75)。多個種類的種內遺傳距離為0，褐菖鲉的種內遺傳距離最大。同屬不同物種間遺傳距離在0.085 1～0.238 5之間，棘鯛屬的黃鰭鯛和黑棘鯛的種間遺傳距離最小，小公魚屬的青帶小公魚和小公魚屬sp.的種間遺傳距離最大，平均種間遺傳距離為0.197 6(SD=0.048 71)，約為種內平均遺傳距離的132倍，符合Hebert P D N等[21]提出的“10×規則”，即序列的種間遺傳距離大于平均種內遺傳距離的10倍以上時才能有效鑒別物種。同科不同屬的僅魚箴科的異鱗魚箴屬和下魚箴屬，屬間遺傳距離為0.216 4。目內科間遺傳距離最小值出現在鱸形目彈涂魚科和蝦虎魚科，為0.153 1；最大值出現在鱸形目羊魚科和魚喜科，為0.269 7；平均科間遺傳距離為0.238 7(SD=0.018 24)。

16S rRNA基因種內的遺傳距離在0～0.002 0之間，平均為0.000 3(SD=0.000 57)，各種類的種內遺傳距離明顯小于其COI序列的遺傳距離。多個種類的種內遺傳距離為0，籃子魚屬sp.的種內遺傳距離最大。同屬不同物種間遺傳距離在0.026 6～0.164 7之間，棘鯛屬的棘鯛屬sp.和黑棘鯛的種間遺傳距離最小，肩鰓鳚屬的斑點肩鰓鳚和肩鰓鳚屬sp.的種間遺傳距離最大，平均種間遺傳距離為0.089 2(SD=0.045 42)，同樣超過種內平均遺傳距離的10倍以上。同科不同屬的魚箴科的異鱗魚箴屬和下魚箴屬，屬間遺傳距離為0.182 3。目內科間遺傳距離最小值同樣出現在鱸形目彈涂魚科和蝦虎魚科，為0.059 1；最大值出現在鱸形目鳚科和銀鱸科，為0.227 5；平均科間遺傳距離為0.162 3(SD=0.033 63)。

由表2可以看出，COI和16S rRNA基因遺傳距離均隨著分類階元的提高而增大，但增幅隨著分類階元的提高越來越小。

表2 不同分類階元遺傳距離

2.4 系統進化樹

基于64條COI基因序列和74條16S rRNA基因序列分別構建系統進化樹(圖2、圖3)。由圖可以看出，基于COI和16S rRNA基因序列的系統進化樹結果基本一致，在種的水平上，聚類效果清晰，所有物種都分別聚為獨立的一支從而被有效區分，同一個種類的不同個體也都能聚在同一個分支。同屬的個體在基于16S rRNA基因構建的系統進化樹上聚類效果也很明顯，如棘鯛屬、銀鱸屬、屬、肩鰓鳚屬、小公魚屬的不同種類分別聚為一支，而基于COI基因構建的進化樹上，肩鰓鳚屬的斑點肩鰓鳚和肩鰓鳚屬sp.并未聚在一支。在科和目的水平上，兩條進化樹的聚類效果都不清晰，聚類關系相互交叉、比較混亂。

3 討論

3.1 COI和16S rRNA基因在仔稚魚種類鑒定中的適用性及在系統進化分析中的局限性

Hebert P D N等[22]的研究表明，同一物種內的遺傳距離多小于0.020，0.020常作為DNA條形碼物種劃分的閾值，另外指出只有種間遺傳距離大于種內遺傳距離的10倍以上時才能有效鑒別物種[21]。

本研究各個種類COI基因的種內遺傳距離(0～0.005 4)均小于0.020，同屬種間的遺傳距離(0.085 1～0.238 5)均大于0.020，符合Hebert P D N等提出的種內遺傳距離的標準，且種間和種內遺傳距離分布范圍沒有交叉，存在明顯的條形碼間隙；平均種間遺傳距離(0.197 6)為種內遺傳距離(0.001 5)的約132倍；以上結果均表明，COI基因可以作為條形碼對仔稚魚進行種類鑒定。16S rRNA基因種內遺傳距離(0～0.002 0)遠小于0.020，同屬種間的遺傳距離(0.026 6～0.164 7)遠遠大于種內遺傳距離分布范圍，平均種間遺傳距離(0.089 2)大于平均種內遺傳距離(0.000 3)的10倍以上，16S rRNA基因同樣也適合用來進行仔稚魚的種類鑒定。另外，基于COI基因和16S rRNA基因構建的系統進化樹也直觀地反映出兩種基因都能將所有物種區別開來，印證了兩種基因在仔稚魚種類鑒定中的適用性。

COI和16S rRNA基因在同科屬間及同目科間的遺傳距離的分布范圍存在重疊，對基于COI和16S rRNA基因構建的系統進化樹的分析也表明，在科和目的水平上，聚類關系不是很清晰。這說明，COI和16S rRNA基因不適合用來分析種以上高分類階元的系統進化關系，這與其他諸多研究者的結論[12，23-24]相一致。

3.2 COI和16S rRNA基因對廈門海域仔稚魚的鑒定結果分析

本研究共選取80尾仔稚魚樣品進行DNA提取、COI和16S rRNA基因的擴增、測序、序列比對與分析。通過序列比對，COI基因將仔稚魚樣品鑒定為26個種類(4個種類的樣品PCR擴增失敗)，16S rRNA基因將仔稚魚樣品鑒定為29個種類(1個種類的樣品PCR擴增失敗)，總的來說，16S rRNA基因通用引物擴增效率高于COI基因。除去擴增失敗的種類，兩種基因的鑒定結果基本一致，存在分歧的3處，多是由于COI基因比對結果與多個近緣種相似而無法確定具體哪個種類，而NCBI數據庫中16S rRNA基因序列數據不足，16S rRNA基因比對結果僅與其中一個種類相似性大于99%。目前，DNA條形碼數據庫并不全面，尤其是一些非經濟種和少見種的COI和16S rRNA基因序列還十分欠缺。另外，數據庫中存在一些錯誤鑒定后提交的序列，如果未能加以甄別則會干擾后續研究者序列的比對和物種鑒定[25]。因此，DNA條形碼基因序列庫的完整和準確是物種鑒定的前提條件[26]，除不斷補充DNA條形碼數據庫外，還必須嚴格開展序列的審查工作，保證數據庫中序列的質量，從而更好地發揮其在物種鑒定中的作用。

本研究中鑒定為鯡形目sp.、小沙丁魚屬sp.、小公魚屬sp.、鲾屬sp.、銀鱸屬sp1.、銀鱸屬sp2.、棘鯛屬sp.、籃子魚屬sp.的種類，經COI或16S rRNA基因比對后，均與數據庫中多個種類高度匹配，相似性均大于99%，無法鑒定到種的水平。說明有些魚類不僅形態上非常相似、無法區分，序列差異也較小，利用COI或16S rRNA基因均無法準確鑒定，這也是利用DNA條形碼技術進行種類鑒定的難點[27]，針對這種情況，仍需要結合更多分子標記(如線粒體Cytb基因、核基因分子標記RAG2等)作進一步研究。

綜上所述，COI和16S rRNA基因均可以作為條形碼對形態學上難以區分的仔稚魚進行種類鑒定，兩種基因鑒定結果基本一致，且多數能鑒定到種的水平，兩種基因結合使用可以相互印證或補充，從而提高鑒定結果的準確性。由于本研究采集到的樣品數量有限，有的種類僅1條序列，相關數據不夠全面，下一步應采集更多季節或月份的仔稚魚樣品，對DNA條形碼技術在仔稚魚種類鑒定中的應用進行更充分的研究和探討。