河豚毒素的性質及應用研究進展

王純純，喬 琨，陳 貝，許 旻，黃鷺強*，劉智禹*

(1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350108；2.福建省水產研究所，國家海水魚類加工技術研發中心，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一種非蛋白高毒性的天然海洋活性物質，于鲀科魚(Tetraodontidae)中發現，因此命名為河豚毒素。TTX主要分布于鲀魚的內臟，不同河鲀間分布差異較大。TTX毒性極強，小鼠腹腔注射的半致死劑量(LD50)僅為 10.7 μg/kg[1]，且穩定性強，一般的處理方式難以降解其毒性。TTX還是一種特殊的選擇性鈉離子通道阻斷劑，現研究熱點多集中于應用于麻醉、戒毒、治療神經類疾病[2]。河鲀味美，但慕名者發生中毒事件屢出不窮，且目前尚無有效的解毒劑。了解TTX的性質對開放河鲀魚市場及保障人類生命安全有著重要的生物學意義，研究TTX的應用可以充分利用TTX的特殊性質，拓寬河鲀的應用效益途徑。本文結合近年TTX的研究進展提出展望，為深入研究TTX的性質及應用提供參考資料。

1 河豚毒素簡介

1.1 TTX理化性質

TTX是許多生物體內含有的一種天然非蛋白毒素，由一個帶有三環正酯的四環骨架和一個環胍部分組成[3]。河豚毒素分子通過胍基與氮原子的質子化形成的陽離子和正羰基的離解作用形成的陰離子相互結合成內鹽[4]。TTX粗品為黃褐色粉末，純品呈白色晶體狀，易潮解，極易溶解于稀酸水溶液，親水性強，呈弱堿性(pKa為8.76)，分子式為 C11H17O8N3，分子量僅為319，屬于氨基全氫喹唑啉化合物。TTX在溶液中有三種結構變化(TTX、內酯型 TTX、半縮醛型 TTX)，TTX理化性質穩定性強，在酸性和中性條件下均具有熱穩定性，高溫下毒性增強；堿性條件下TTX在90℃～100℃與5%氫氧化鉀溶液作用分解成C9堿，可通過其熒光發色基團進行TTX的化學檢測[5]。

1.2 河豚毒素的致毒機理

電壓門控鈉離子通道是一種跨膜蛋白，在細胞電信號中發揮重要作用。其活性受細胞膜電位的調節，開放的通道允許離子沿電化學梯度在細胞膜上移動。TTX的胍基在人體內發生了質子化而帶上正電，因此能夠結合電壓門控鈉通道，結合鈉離子通道側鏈上帶負電的羰基導致鈉離子無法進入通道。TTX能與鈉離子通道受體特異性靶分子結合位點Ⅰ結合，使得鈉離子無法進入離子通道中，其阻塞造成神經興奮傳導速率減慢，從而間接影響神經中樞和神經末梢，引起麻痹、血壓下降。攝入河豚毒素的中毒患者終因呼吸麻痹引起呼吸衰竭而死亡[6]。一些研究人員研究了TTX對小鼠和兔子的毒性。小鼠腹腔注射、皮下注射和灌胃給藥毒素的半致死劑量(LD50)分別為10.7、12.5、532.0 μg/kg，發現雄性小鼠對TTX更敏感。另一方面，肌肉注射和靜脈注射的兔子的最小致死劑量(MLD)分別為5.3、3.1 μg/kg，而致死劑量(LD)分別為5.8、3.8 μg/kg。此外，經腹腔注射TTX對小鼠的毒性比口服TTX高約50倍[1]。

2 河鲀體內河豚毒素的來源

TTX廣泛存在于各個物種中，分布呈現特異性、地域性、季節性等特點，其共性是與水生生態高度相關。因此關于河鲀體內TTX的來源目前出現了兩個爭端，分為外源性起源和內源性起源。外源性是指來自食物網攝入產生毒素的途徑。內源性則是指含有毒素的生物體自身合成毒素的途徑。

2.1 河豚毒素在河鲀中的分布

河鲀是中國海域中常見的有毒魚種，TTX分布于大部分有毒河鲀中(表1)。TTX含量與河鲀品種、組織、季節顯著相關，親緣關系較近的河鲀魚種體內TTX含量相似[7]。一般，河鲀組織器官中毒性較強的有卵巢、肝臟和皮膚，精巢和肌肉毒性較低甚至無毒。但河鲀種間組織分布差異性極大，且在不同捕撈季節檢出的毒性大小也不同[8]。盧義博等[9]通過灌胃實驗分析TTX在暗紋東方鲀不同組織器官中的轉移分布規律，各個器官對TTX有不同的作用功能，如腸道作為攝食的屏障阻礙TTX的吸收，因此在灌胃初期會檢測到大量TTX，隨時間延長，TTX含量下降，TTX轉移到肝臟、皮膚、肌肉、性腺等組織中；鰓是河鲀排泄的主要器官，所以TTX含量極小；幼年河鲀的TTX主要蓄積在皮膚，成年河鲀則主要蓄積在肝臟，性成熟后TTX轉移到卵巢；TTX轉移至代謝器官(膽囊、脾臟、腎臟)前濃度先升高后下降，推測這些器官在TTX的代謝和消除前期都發揮了重要作用。

表1 河豚毒素在河鲀體內的分布情況

續表1

2.2 內源性起源學說

主張內源性起源的學者認為河鲀體內的毒素是通過河鲀體內某種特殊的機制或由微生物將攝入的食物反應而生成毒素。但是始終沒有相關證據證實這一學說的真實性，因此該學說不被大眾認可[37]。Matsumura K[38]證明了河鲀具有產生河豚毒素的能力，通過對劇毒的河鲀卵母細胞進行人工授精和培養，發現胚胎的毒素水平隨著發育而不斷增加，這表明胚胎在發育過程中增加的河豚毒素是胚胎的產物，因為胚胎不太可能從培養液中攝取毒素。對于河豚毒素的隨機性，Tanu M B等[39]提出一種觀點，他認為河豚毒素在生物體內以一種無毒的前體或類似物形式存在，而生物體在自身體內微生物的作用下以及外界環境的影響下將其轉化為劇毒的河豚毒素。

2.3 外源性起源學說

早在1982年Matsui T等[40]就發現河鲀在孵化后用無毒飼料人工飼養時變得無毒，從此開啟了外源性起源學說的研究熱潮。2006年研究人員發現網箱養殖或陸養可獲得無毒的河鲀，也驗證了河豚毒素來源于攝食[41]。在封閉環境下，河鲀被喂養無毒飼料后，檢測發現其不產生毒性，而無毒河鲀口服有毒飼料后能迅速積累TTX[42]，進一步補充了TTX來源于外界的證據。另外，研究人員利用免疫組織化學技術，將河鲀的組織切片放入含有TTX的培養液中，發現組織切片能夠攝入TTX，有利地證明組織不能分泌TTX，而是吸收體外的TTX[43]，且通常大多數河鲀魚的消化道是檢測到TTX含量最多的組織[25]，而消化道是攝食的第一道屏障；這些發現不僅證實TTX是來源于體外，還揭示了食物鏈這一來源途徑。

許多研究人員認為從海洋和淡水沉積物中分離的TTX產生菌通過食物網在小型浮游動物和碎屑喂食者體內積累毒素，從而在大型動物體內積累毒素[44]。最近平角渦蟲(Planoceramultitentaculata)已被認為是河豚毒素在海洋動物體內積累的重要中間體，為細菌生產者和脊椎動物體內攜帶河豚毒素的物種提供了重要的聯系[45]。TTX分布于平角渦蟲的所有三個系統發育類群(古線蟲、竹節線蟲和線蟲)的各個屬當中。其中特別令人感興趣的是頭孢菌屬的線蟲，它可以積累極高數量的TTX，這使它們具有與河鲀相同的毒性水平[46]。實驗證明，擬頭孢菌素提取物對TTX有很強的毒性相關作用[47]。TTX產生菌的種類和數量在不斷增加，已報道的菌株大多屬于弧菌屬(Vibrio)。除弧菌外，產生TTX的細菌種類較多，包括假單胞菌、芽孢桿菌、氣單胞菌、放線菌、沙雷氏菌、微桿菌和希瓦氏菌[48]。

河豚毒素是一種生物二級代謝物，而微生物種間的相互協調會影響微生物次級代謝物的生產，次生代謝物的生物合成途徑對于闡明河豚毒素的遺傳基礎至關重要[49]。目前微生物分離出的TTX含量極低，僅為ng級別，且暫無特定技術能夠證明TTX來源于微生物，由此可知河鲀體內的TTX并非完全來源于微生物，可能與微生物種間或微生物與機體相互協調有關。這些途徑主要由編碼特定酶的基因的轉錄活性控制，這種酶進一步編碼在細菌基因組中[50]，即表達毒素生物合成途徑的基因聚集在細菌基因組中。因此，關注細菌基因組可以更容易地理解TTX的起源和產生。

3 河豚毒素的耐受與富集

3.1 河豚毒素結合蛋白

含有TTX的生物體是如何抵抗TTX高毒性而存活的？其在體內富集的途徑是怎樣的？解答這兩個問題，主要考慮兩方面的因素。第一，河鲀體內存在河豚毒素結合蛋白，它消除了毒素的影響，同時這一物質還起到了轉運毒素的作用。第二，鈉離子通道關鍵性氨基酸的改變，使得TTX失去作用靶點，無法致毒。

2000年Matsui T等從星點東方鲀血漿得到一種河豚毒素結合蛋白，其與TTX結合能力高達66%，但其僅在中性pH條件下通過特異性結合才能有效抵御來自TTX的傷害[51]。2001年Shoji Y等[52]從河鲀(Fugupardalis)血漿中分離出一種具有可溶性且能與石房蛤毒素(STX)和TTX結合的二聚體糖蛋白，被稱為PSTBP(Pufferfishsaxitoxin and tetrodotoxin binding protein)，與Matsui T等[51]發現的河豚毒素結合蛋白同源。隨后在2013年Yotsu-Yamashita M等采用免疫組織化學方法研究了PSTBP在豹紋多紀鲀腸道、肝臟、卵巢、皮膚和骨骼肌中的分布規律，推測PSTBP是TTX在組織間，特別是肝臟、卵巢和皮膚之間轉移的載體蛋白，PSTBPs定位于TTX分泌腺周圍的真皮而后向腺體運輸和提供TTX[53]。Satone H等[54]研究了重組紅旗東方鲀河豚毒素結合蛋白I型和 Ⅱ 型(rTrub.PSTBP1和rTrub.PSTBP2)分別與TTX和石房蛤毒素(STX)的結合能力，兩種蛋白都與三丁基錫結合，但在熱變性時失去了這種能力，只有rTrub.PSTBP2在熱變性的條件下也能與TTX結合，這一現象提示PSTBP2的氨基酸序列可能與TTX的親和力有關。Yotsu-Yamashita M等[55]在2018年調查了除東方鲀以外的四種有毒河鲀[黑斑叉鼻鲀(Arothronnigropunctatus)、紋腹叉鼻鲀(A.hispidus)、菲律賓叉鼻鲀(A.manilensis)、凹鼻鲀(Chelonodonpatoc)]中PSTBP類似物的存在，結果表明PSTBP不是東方鲀屬特有的蛋白，同時也分布在有毒河鲀的其他屬。Qiao K等[56]在2021年克隆了來自菊黃東方鲀卵黃蛋白原的cDNA，重組表達蛋白產物與TTX結合可以有效降低毒性，且河鲀體內不同組織和發育階段的卵黃蛋白原表達差異表明，結合蛋白可參與TTX的轉運。這些研究均表明PSTBP及其類似物與有毒河鲀體內TTX的積累有關。河豚毒素結合蛋白在河鲀體內組織分布的豐富度以及與毒素含量的高度相關性，可以推測這類蛋白可以作為轉運蛋白來幫助河鲀抵御毒性。

3.2 鈉離子通道蛋白氨基酸突變

TTX阻止鈉離子通過細胞膜進行移動，并通過與神經和肌肉中電壓門控鈉通道的外孔結合來阻止控制神經沖動的動作電位。對TTX耐受動物的鈉通道蛋白關鍵位置或外孔中其他位置的氨基酸被替代，抑制了與TTX的結合而改變了這一致毒機制，從而產生TTX抗性。TTX耐受生物在電壓門控鈉通道基因中包含多個突變，每個突變都有助于提高對TTX的抗性。

含有TTX的河鲀體內電壓門控鈉通道Ⅳ-α亞單位(SCN4a)發生了突變，TTX與通道的親和力顯著降低，相差15倍[57]。除了河鲀外，研究動物模型中最經典便是蠑螈和吊帶蛇，兩者在長期軍備競爭共同進化中逐漸衍生出TTX抗性，吊帶蛇的TTX抗性似乎具有相對簡單的遺傳基礎，作為TTX分子靶標的肌肉和神經中表達的鈉通道外孔(P環)發生結構變化。骨骼肌鈉通道(Nav1.4)的功能變異對于促進整個動物的TTX抗性顯得尤為重要[58]，編碼該蛋白(SCN4a)基因的等位基因變異似乎是造成吊帶蛇屬(劍紋帶蛇、海岸帶蛇)種群內部和種群之間表型巨大差異的原因[59]。還有一有利的證據便是生物體表現出來的生理變化，對TTX抗性最強的劍紋帶蛇Nav1.4中氨基酸發生了置換，因該置換減少了TTX與骨骼肌鈉通道的連接，損害了離子通道功能，所以劍紋帶蛇的爬行速度較慢[60]。

4 河豚毒素的應用

TTX作為一種治療藥物具有重要的屬性，對電壓依賴性鈉離子通道(Voltage-gated sodium channels，VGSCs)的高度特異性、選擇性阻斷Na離子通道、無法穿越血腦屏障，因此TTX應用范圍廣泛。

1)戒毒：TTX可減輕急性海洛因戒斷綜合征，可能是由于其對外周鈉通道的影響。許多研究表明，戒斷癥狀與阿片類、中樞膽堿能、中樞腎上腺素能、中樞多巴胺受體有關。TTX是可逆的鈉通道傳導的選擇性抑制劑，可以阻斷神經傳導，進而影響遞質釋放的效率[61]。2001年Chen S Q等[62]發現使用TTX可抑制大鼠和小鼠的嗎啡戒斷癥狀，給藥過程中沒有改變麻醉大鼠中的心率、血壓和呼吸率。2009年Shi J等[63]首次采用隨機、雙盲、安慰劑對照研究TTX對戒斷海洛因的能力，受試者在戒斷過程中減少了焦慮和渴望等癥狀。TTX用于戒毒不僅能夠有效減輕戒斷癥狀，還不會影響戒毒者的心肺功能，具有良好的應用前景。

2)鎮痛：TTX是一種能阻斷神經元上的電壓門控鈉通道的小分子，通過引發和傳導外周神經系統中的脈沖來抑制鎮痛。有新的臨床實驗表明患者以4 d為一個治療周期使用TTX后，鎮痛效果可延續一周甚至長達一個月，其機制可能是由于位于傷害性神經元外圍的Nav1.7部分鈉離子通道發生了堵塞[64]。與一般的鎮痛藥不同，TTX不會引起直接的心肌抑制，并且穿過血腦屏障的能力較差，因此降低了癲癇發作和中樞神經系統受損的風險。加拿大已在進行TTX臨床Ⅲ期試驗，將其作為針對治療癌癥晚期發作的癌性疼痛的全身鎮痛藥，尤其是針對神經性疼痛[65]。

3)麻醉：背根神經節(Dorsal root ganglion，DRG)是外周傷害感受性信號傳入的重要中轉站，其表達多個鈉離子通道，如NaV1.7～NaV1.9、NaV1.3 和 NaV1.1，而TTX可高效阻斷NaV1.7、NaV1.3、NaV1.1。TTX親水性強，透過血腦屏障、血-脊髓屏障可能性極小，因此作為局部麻醉劑有極大的優勢。此外，與一般麻醉劑相比較，TTX對心臟、局部神經、肌肉的毒性極小。但TTX神經毒性大，藥物安全性低，因而限制了其作為局部麻醉劑的應用。研究人員多年來致力于提高TTX用藥的安全性，目前有兩種方式：(1)與腎上腺素能藥物一同使用，可降低TTX的整體有效毒性，且麻醉時間可以延長；(2)延遲藥物的釋放，可顯著延長TTX暴露于神經的時間，并可保持局部高濃度。其中最普通的靶向給藥方式就是與可降解的聚合物顆粒結合，構建可控的藥物遞送體系。另外，遠程觸發藥物遞送系統，利用脂質體包裹TTX，以外界安全的觸發手段(電磁場、超聲波、紅外光)產生熱量，使藥物釋放[66]。Zhao C等[67]將TTX與可生物降解的聚合物通過可水解的酯鍵共價結合，可防止TTX的起始釋放，酯鍵緩慢水解可控制TTX釋放速率，使得TTX精準地投入到目標組織中。研究人員還利用化學滲透增強劑(CPEs)來增強TTX對神經的滲透，提高藥物的有效性，從而減少TTX的用量，提高用藥的安全性。

4)治療失眠：微量注射TTX，腦橋區的活性降低，導致快速眼動睡眠時間和非快速眼動睡眠時間減少，證明TTX影響生物的睡眠-覺醒狀態[68]，有治療失眠等睡眠問題的潛能。

5)抗心律失常：抗心律作用機制為TTX阻斷鈉通道后，使快反應細胞膜和心肌細胞膜的最大除極速率顯著降低，快反應組織的自律性降低，傳導減慢、不應期延長，因此心率得到抑制、心臟室顫拮抗。微量TTX與市面上的抗心律失常藥劑聯用，可增強藥效[69]。

6)作為抑制病毒主要蛋白酶的有效化合物：SARS-CoV-2的主要蛋白酶(Mpro)是介導病毒復制和轉錄的關鍵酶，Law W Y等[70]通過計算機輔助藥物設計篩選發現TTX是抑制SARS-CoV-2Mpro的有效活性化合物。

7)研究輔助標準：TTX是著名的特異性鈉通道阻斷劑，TTX直接或間接地影響著生命維持的重要活動，TTX僅與VGSC結合，因此，它是幾十年來研究人員用來表征VGSC結構和功能的黃金標準，包括區分河豚毒素敏感(TTX-IC50～10 nm)和河豚毒素耐藥(TTX-IC50≥1μmol/L)VGSC[71]。如Chen L等[72]發現TTX敏感鈉離子電流密度和Nav1.6是介導長春新堿用于化療中引起疼痛周圍神經病變的關鍵，對于研究疼痛機制以及各類神經有著重要的幫助。

5 總結與展望

TTX是一種極具價值和研究意義豐富的天然物質，其毒性與神經系統密切相關的聯系是研究的熱點。關于TTX的來源，外源學說支持的證據較多，推測為主要產生途徑；內源學說證據較為單薄，懷疑是河鲀體內某種物質復雜反應的偶然性結果，有待進一步考證。TTX從外來攝入物質到體內的轉運機制以及過程中發生的化學反應，通過何種途徑代謝，暫無相關解釋。河豚毒素結合蛋白的研究集中于分離、體外結合能力的測定及進化的相關基因等方面，但結合后的蛋白在體內如何作用、代謝、轉運都沒有具體的研究。

鈉離子通道蛋白特定位點氨基酸突變推測對生物體耐受TTX起到了重要作用。近期，Shen H Z等發現TTX與STX通過與Nav通道孔區的選擇性濾器結構域形成大量的氫鍵，使其能穩定的堵在孔區，從而阻斷了鈉離子正常通過選擇性濾器的通路[73]。這一突破揭示了TTX較認知中更復雜的毒性機制，鈉離子通道的選擇性識別機制還未有探索，耐受TTX動物體內鈉離子通道蛋白結構仍未有具體解析，因此TTX的耐受機制仍待進一步完善。

TTX具有極高的醫療價值，在藥物緩釋體系發展的逐漸進步中克服了其本身的臨床受限，并且在麻醉鎮痛方面取得了一定的成效。目前改善TTX治療指數的思路應集中于增強其與神經的作用放大療效、減慢釋放的速率、精準定位作用靶點。河豚毒素與神經系統的密切聯系可為許多疾病的治療提供新的思路及研究方向。

據此，TTX未來研究發展總結為四個方面：(1)分離合成更多未報道過的河豚毒素結合蛋白，解析其與TTX復合蛋白的具體結構，了解其具體作用機制；(2)探究鈉離子通道選擇性識別機制，深入了解TTX識別結合過程，突破利用TTX作為藥用的瓶頸；(3)研究TTX及其代謝物的基因表達情況，明細其信號因子調控模式，才能做到真正溯源；(4)豐富TTX的應用，必須提高TTX的治療指數，可研發新的藥物載體，優化其性能，以爭早日實現“反毒為藥”。