不同水稻品種幼苗響應(yīng)堿脅迫的生理差異及脅迫等級構(gòu)建

2021-11-04 05:23:16路旭平李芳蘭石亞飛張娟偉楊文偉羅成科田蕾李培富

生態(tài)環(huán)境學(xué)報 2021年8期

路旭平，李芳蘭，石亞飛，張娟偉，楊文偉，羅成科，田蕾，李培富

寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院/寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室，寧夏銀川 750021

土壤鹽堿化是導(dǎo)致耕地面積減少的重要原因之一，對農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生了負面的影響。據(jù)報道，中國鹽堿地主要分布在東北松嫩平原、黃淮海平原、西北干旱半干旱區(qū)和濱海等地（Wang et al.，2017；羅成科等，2019）；面積達0.99億公頃，約占全世界鹽堿地面積的10.3%，且呈逐年增加的趨勢（冷春旭等，2020）。水稻（Oryza sativa L.）是中國三大糧食作物之一，中國超過60%的人口以稻米作為主糧（姚棟萍等，2019）。水稻屬中等鹽敏感的作物（Flowers et al.，2008），利用種植水稻來改良鹽堿地，可以使土壤表層的鹽分逐漸下沉，改良土壤結(jié)構(gòu)（冷春旭等，2020）；并且水稻根系具有分泌有機酸和吸收環(huán)境中鹽分的作用，可以中和堿脅迫引起的高pH并改善土壤板結(jié)情況，使土壤結(jié)構(gòu)變得疏松，提高土壤蓄水能力（梁銀培等，2017）。因此，合理有效地開發(fā)和利用鹽堿地，對保障國家的糧食安全具有重要意義。

研究表明，土壤鹽堿化包括兩種不同的類型，即中性鹽（NaCl和 Na2SO4）和堿性鹽（NaHCO3和 Na2CO3）引起的兩種不同類型的鹽脅迫，植物對此有不同的響應(yīng)和耐鹽機制（Guo et al.，2020）。由中性鹽引起的脅迫稱為鹽脅迫，對植物的主要傷害是由滲透脅迫和離子毒害引起的（劉建新等，2020）；由堿性鹽引起的脅迫稱為堿脅迫，主要是由于高pH值使土壤中營養(yǎng)元素固化，嚴重干擾植物根系對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收，導(dǎo)致植物體內(nèi)營養(yǎng)失衡，新陳代謝紊亂，破壞離子平衡；同時堿脅迫具有與鹽脅迫相同的滲透脅迫和離子毒害（Guo et al.，2017；Zhang et al.，2017）。

植物遭受堿脅迫時，由于具有較高pH值，使植物遭受鹽分和高pH值雙重損傷，堿脅迫對植物造成的傷害遠大于鹽脅迫（徐寧等，2017）。高pH會嚴重阻礙植物對水和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，造成滲透脅迫；干擾植物細胞內(nèi)的電荷平衡和pH內(nèi)穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生活性氧，降低膜脂透性，破壞細胞結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致生理代謝紊亂，抑制植物生長發(fā)育（穆陽杰等，2020）。國內(nèi)外有關(guān)水稻耐鹽堿研究主要集中在鹽脅迫（黃潔等，2020），對堿脅迫下水稻體內(nèi)反應(yīng)機理和調(diào)節(jié)機制的研究較少（趙懷玉等，2020），關(guān)于堿脅迫對水稻幼苗生理生化特性的影響缺乏系統(tǒng)性的研究，依據(jù)生理生化指標(biāo)計算脅迫指數(shù)并確定脅迫等級的方法更為少見。因此本研究以堿敏感水稻品種和耐堿品種為供試材料，在水稻苗期進行堿脅迫處理，通過比較分析供試水稻的葉綠素含量、活性氧代謝、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累和抗氧化防御等生理指標(biāo)，進一步明確不同水稻品種在堿脅迫下的生長和生理差異，并根據(jù)生理指標(biāo)劃分水稻苗期堿脅迫等級，以期為“以稻治堿”和水稻耐堿機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為2個不同耐堿性的水稻品種，即堿敏感品種“中花 11”（ZH11）和耐堿品種“寧粳52”（NG52），供試水稻種子由寧夏大學(xué)寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室提供。

1.2 試驗設(shè)計

選取大小一致、籽粒飽滿的水稻種子，蒸餾水浸泡1 h，75%的乙醇浸泡15 s，15%的NaClO消毒30 min，蒸餾水潤洗6次后用濾紙吸干水分。將消毒后的水稻種子置于長×寬×高為100 cm×50 cm×10 cm，共 32孔的育苗盤中，放置于人工氣候箱（HP1000GS）中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為16 h/8 h（光照/黑暗），溫度28 ℃/25 ℃（白天/夜間）。種子萌發(fā)4 d后，選取長勢一致幼苗轉(zhuǎn)移到剪去管底的96孔PCR板上，每板48株，將轉(zhuǎn)移到PCR板上各材料置于長×寬×高為21 cm×15 cm×5.2 cm水培盒中進行培養(yǎng)。水稻移栽2 d后加入1/2國際水稻所（IRRI）水稻專用營養(yǎng)液，5 d 后加入全營養(yǎng)液，以后每隔3 d更換700 mL水稻營養(yǎng)液，國際水稻所水稻專用營養(yǎng)液配方的質(zhì)量濃度為（mg·L?1）：NH4NO3114.3、NaH2PO4·2H2O 50.4、K2SO489.3、CaCl2110.8、MgSO4·7H2O 405、NaSiO3·9H2O 568、MnCl2·4H2O 1.8 、 Na2MoO4·2H2O 0.126、H3BO41.145、ZnSO4·7H2O 0.044、CuSO4·5H2O 0.039、FeSO4·7H2O 9.93。幼苗生長至第28天進行堿脅迫處理。

試驗選用兩種堿性鹽（NaHCO3和Na2CO3）混合設(shè)置 3個堿水平：10、20、30 mmol·L?1；每組處理下，將兩種堿性鹽（NaHCO3、Na2CO3）按照不同物質(zhì)的量比例分別（9∶1、5∶5、1∶9）混合，形成 3個pH環(huán)境：pH 8.65、pH 9.55和pH 10.50，依次記為A、B、C處理；共模擬出9種堿脅迫環(huán)境（表1），其中10A、10B、10C處理相當(dāng)于輕度堿化土，20A、20B、30A處理相當(dāng)于中度堿化土，20C、30B、30C處理相當(dāng)于重度堿化土（楊佳佳等，2011）。處理液為700 mL含NaHCO3和Na2CO3的營養(yǎng)液，以僅含營養(yǎng)液的處理為對照，每個處理3次重復(fù)，連續(xù)脅迫處理3 d后采集樣品測定各項指標(biāo)。

表1 各處理堿組成和pHTable 1 Alkali composition and pH of each treatment

1.3 測定項目與方法

1.3.1 生長指標(biāo)的測定

葉片相對含水量（RWC）：取處理3 d后的幼苗葉片，稱量其鮮重（mf）并記錄，葉片浸泡于蒸餾水中過夜，吸干表面水分后稱量其飽和重（mt），將飽和葉片放入烘箱中105 ℃處理15 min，75 ℃烘干至恒重，稱量其干重（md），計算葉片相對含水量：w(RWC)=(mf?md)/(mt?md)×100%

1.3.2 生理指標(biāo)的測定

葉綠素含量的測定采用乙醇提取法（羅姍姍等，2019），計算葉綠素 a含量（chlorophyll a，Chla）、葉綠素b含量（chlorophyll b，Chlb）、總?cè)~綠素含量（chlorophyll，Chl）和葉綠素 a/b（chlorophyll a/b，Chla/b）；

游離脯氨酸（proline，Pro）含量采用酸性茚三酮比色法測定（鄒琦，2000）；采用苯酚法測定可溶性糖含量（soluble sugar，SS）（鄒琦，2000）；可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量采用考馬斯亮藍G-250染色法（鄒琦，2000）。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定（Zhang et al.，2017）；脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性的測定參考Huang et al.（2010）的方法；超氧陰離子（O2·-）產(chǎn)生速率采用對氨基苯磺酸法測定（Zhang et al.，2017）；H2O2含量采用碘化鉀法測定（Zhang et al.，2017）。

粗酶液的制備參考Niu et al.（2017）的方法，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）采用氮藍四唑顯色法測定（Niu et al.，2017）；過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用紫外比色法測定（Niu et al.，2017）；過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定（Wang et al.，2013）。

還原型抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）和還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）測定參照Wang et al.（2013）的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用Microsoft Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)，SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析和主成分分析，差異顯著性定義為 P<0.05，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（±SE）表示 3次重復(fù)測定結(jié)果；運用GraphPad Prism 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫對水稻葉片葉綠素含量的影響

由圖1A可知，堿水平和pH均顯著影響ZH11的葉綠素a含量（P<0.001），且堿水平和pH對葉綠素 a含量具有顯著的交互作用（P=0.015），在30C處理時葉綠素a含量最低，較對照（CK）降低82.12%。NG52的葉綠素a含量的主效應(yīng)分別受堿水平和 pH影響，但堿水平和 pH的交互作用對NG52的葉綠素a含量無顯著影響（P=0.289），葉綠素a含量在30C處理下較CK下降61.56%。對比各處理下的兩種材料發(fā)現(xiàn)，在CK時ZH11和NG52葉綠素 a含量差異不顯著，但在 10A、10B、10C和30C處理時存在顯著差異（P<0.05）。

圖1 堿脅迫對水稻葉片葉綠素含量的影響Fig. 1 Effects of alkali stress on chlorophyll contents of rice leaves

由圖1B可得，堿水平和pH對ZH11的葉綠素b含量的主效應(yīng)具有顯著影響（P<0.001，P<0.001），但堿水平和pH的交互作用對ZH11的葉綠素b含量無顯著影響（P=0.157）。堿水平和pH對NG52的葉綠素b含量的主效應(yīng)具有顯著影響（P=0.002，P<0.001），但堿水平和pH的交互作用對NG52的葉綠素 b含量無顯著影響（P=0.470）。ZH11和NG52的葉綠素b含量在30C處理時下降至最低點，分別較CK降低63.29%和59.50%。比較兩種材料葉綠素b含量可得，在10A、10B和10C處理時，NG52葉綠素b含量顯著高于ZH11（P<0.05），而在其他處理時無顯著差異。

由圖1C可知，堿水平和pH對ZH11的總?cè)~綠素含量的主效應(yīng)具有顯著影響（P<0.001），但堿水平和pH的交互作用對ZH11的總?cè)~綠素含量無顯著影響（P=0.051）。堿水平和pH對NG52的總?cè)~綠素含量的主效應(yīng)具有顯著影響（P=0.002，P<0.001），但堿水平和pH的交互作用對NG52的總?cè)~綠素含量無顯著影響（P=0.462）。ZH11和NG52的總?cè)~綠素在30C處理時降至最低點，降幅分別為76.63%和60.94%。對比兩種材料在各處理下的葉綠素含量發(fā)現(xiàn)，在CK處理下，ZH11和NG52葉綠素含量差異不顯著；但在 10A、10B、10C和30C處理時，NG52葉綠素含量顯著大于 ZH11（P<0.05）。

分析圖1D可得，ZH11的葉綠素a/b的主效應(yīng)受堿水平和pH顯著影響（P<0.001），堿水平和pH對葉綠素a/b具有顯著的交互作用（P<0.001）。堿水平和pH對NG52的葉綠素a/b的主效應(yīng)具有顯著影響（P=0.002，P=0.001），堿水平和 pH的交互作用對 NG52的葉綠素 a/b具有顯著影響（P<0.001）。ZH11和NG52的葉綠素a/b在30C處理較CK分別降低51.30%和5.07%；在30A處理時，NG52葉綠素a/b顯著增加（P<0.05），較CK增加15.43%。對比兩種材料發(fā)現(xiàn)，在CK時ZH11和NG52葉綠素a/b無顯著差異，但從10C至30C處理時，NG52葉綠素a/b顯著大于ZH11（P<0.05）。

綜合分析圖1A、C、D發(fā)現(xiàn)，在30A處理下ZH11和NG52的葉綠素a含量、總?cè)~綠素含量和葉綠素 a/b較20C處理均有增加，說明當(dāng)堿水平大于20 mmol·L?1時，低堿水平和高pH的交互作用對水稻葉綠素的影響大于高堿水平低 pH的交互作用。

2.2 堿脅迫對水稻葉片相對含水量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖2A可知，堿水平和pH對ZH11和NG52葉片相對含水量的主效應(yīng)均具有顯著的影響，且堿水平和pH的交互作用對ZH11和NG52葉片相對含水量具有顯著影響（P=0.001，P=0.004）。ZH11和NG52葉片相對含水量在30C處理較CK分別降低了41.18%和29.53%。分析兩種材料葉片相對含水量發(fā)現(xiàn)，在CK時ZH11和NG52葉片相對含水量無顯著差異，但隨著脅迫程度的增加，在30A、30B和30C處理時，NG52葉片相對含水量顯著大于ZH11（P<0.05）。

圖2 堿脅迫對水稻葉片相對含水量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響Fig. 2 Effects of alkali stress on relative water content and osmotic adjustment substances of rice leaves

分析圖2B可知，堿水平和pH對ZH11和NG52的Pro含量主效應(yīng)均具有顯著的影響（P<0.001）。堿水平和pH的交互作用對ZH11的Pro含量具有顯著影響（P=0.004），對NG52的Pro含量無顯著影響（P=0.695）。ZH11和NG52的Pro含量在30C處理時達到最大值，分別較 CK增加 326.83%和368.99%。比較兩種材料在各處理下的 Pro含量可得，在CK時ZH11和NG52的Pro含量差異不顯著；在10B、10C、20A、20B和30C處理時，NG52的Pro含量顯著高于ZH11（P<0.05）。

由圖2C可得，堿水平和pH對ZH11和NG52的SS含量主效應(yīng)均具有顯著的影響（P<0.001），且堿水平和pH的交互作用對ZH11和NG52的SS含量具有顯著影響（P<0.001）。ZH11和NG52的SS含量在30C處理時達到最大值，分別較CK增加49.49%和77.40%。比較各處理下兩種材料的SS含量發(fā)現(xiàn)，在CK時ZH11的SS含量顯著大于NG52（P<0.05），但隨著脅迫程度的增加，NG52的 SS含量的增幅逐漸大于ZH11，其中在10C、30A、30B和30C處理時顯著大于ZH11（P<0.05）。

分析圖2D可得，堿水平和pH對ZH11和NG52的SP含量主效應(yīng)均具有顯著的影響（P<0.001）。堿水平和pH的交互作用對ZH11和NG52的SP含量具有顯著影響（P=0.001，P=0.007），ZH11和NG52的SP含量在30C處理時達到最大值，分別較CK增加54.67%和129.00%。對比各處理下兩種材料的SP含量發(fā)現(xiàn)，在CK時ZH11的SP含量是NG52的1.60倍，但在30C處理時ZH11的SP含量是NG52的1.08倍。

綜合分析圖2A、B、C、D發(fā)現(xiàn)，ZH11和NG52的相對含水量在30A處理下較20C處理均有增加，SS含量在 30A處理下較 20C處理顯著降低（P<0.05），Pro和SP含量30A處理與20C處理相比無顯著差異。

2.3 堿脅迫對水稻葉片脂質(zhì)過氧化和活性氧含量的影響

分析圖3A可得，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的MDA含量（P<0.001），且兩者的交互作用也顯著影響 ZH11和 NG52的 MDA含量（P=0.014，P=0.047）。ZH11和NG52的MDA含量在 30C處理時升高至最大值，較 CK分別增加86.32%和50.02%。對比各處理下兩種材料的MDA含量發(fā)現(xiàn)，在CK時，ZH11和NG52 MDA含量差異不顯著；但隨著脅迫程度的增加，ZH11 MDA含量均大于NG52，除20B和30A處理外，其余各處理ZH11 MDA含量均顯著高于NG52（P<0.05）。

圖3 堿脅迫對水稻葉片脂質(zhì)過氧化和活性氧含量的影響Fig. 3 Effects of alkali stress on lipid peroxidation and reactive oxygen species of rice leaves

由圖3B可知，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的LOX活性（P<0.001），但兩者的交互作用未顯著影響 ZH11和 NG52的 LOX活性（P=0.775，P=0.144）。ZH11和NG52的LOX活性在30C處理時增幅分別為277.92%和191.55%。分析兩種材料在各處理下的LOX活性發(fā)現(xiàn)，ZH11和NG52 LOX活性在CK時差異不顯著；但隨著脅迫程度的增加，從10B—30C處理ZH11 LOX活性均顯著大于NG52（P<0.05）。

分析圖3C可得，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的O2·-產(chǎn)生速率（P<0.001），且兩者的交互作用對 ZH11和 NG52的 O2·-產(chǎn)生速率具有顯著影響（P=0.004，P=0.007）。ZH11和NG52的O2·-產(chǎn)生速率在30C處理時升高至最大值，增幅分別為161.70%和130.39%。比較各處理下兩種材料的O2·-產(chǎn)生速率發(fā)現(xiàn)，在整個脅迫期間，ZH11的O2·-產(chǎn)生速率均顯著高于NG52（P<0.05）。

由圖3D可得，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的H2O2含量（P<0.001），且兩者的交互作用對ZH11和 NG52的 H2O2含量具有顯著影響（P=0.001，P<0.001）。ZH11和NG52的H2O2含量在30C處理時升高至最大，增幅分別為291.40%和124.06%。分析各處理下兩種材料的H2O2含量發(fā)現(xiàn)，ZH11和NG52的H2O2含量在CK時差異不顯著；但隨著脅迫程度的增加，從10C到30C處理ZH11的H2O2含量均顯著大于NG52（P<0.05）。

綜合分析圖3A、B、C、D發(fā)現(xiàn)，ZH11和NG52的O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量以及ZH11的MDA含量和LOX活性在30A處理下較20C處理顯著降低（P<0.05），NG52的MDA含量和LOX活性在30A處理與20C處理相比無顯著差異。

2.4 堿脅迫對水稻葉片抗氧化酶活性的影響

由圖4A可知，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的SOD活性（P<0.001），兩者的交互作用對NG52的SOD活性具有顯著影響（P=0.001），對ZH11的SOD活性無顯著影響（P=0.081）。ZH11和 NG52的 SOD活性在 30C處理下增幅分別為99.71%和 145.61%。分析兩種材料在各處理下的SOD活性發(fā)現(xiàn)，在CK時ZH11的SOD活性顯著大于 NG52（P<0.05），但隨著脅迫程度的增加，NG52的SOD活性的增幅逐漸大于ZH11，其中在20C、30B和30C處理時顯著大于ZH11（P<0.05）。

圖4 堿脅迫對水稻葉片抗氧化酶活性的影響Fig. 4 Effects of alkali stress on antioxidant enzyme activities of rice leaves

分析圖4B可知，堿水平和pH對ZH11和NG52的 POD活性的主效應(yīng)均產(chǎn)生顯著影響，兩者的交互作用對ZH11和NG52的POD活性無顯著影響（P=0.281，P=0.305）。ZH11和NG52的在30C處理時較CK增幅最大，分別為17.60%和37.30%。比較各處理下兩種材料的 POD活性得，在各個處理下，NG52的POD活性均顯著大于ZH11的POD活性（P<0.05）。

由圖4C可知，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的CAT活性，兩者的交互作用對NG52的CAT活性具有顯著影響（P=0.005），對 ZH11的CAT活性無顯著影響（P=0.775）。ZH11和NG52的CAT活性在30C處理時較CK增幅最大，分別較較CK增加79.25%和116.22%。分析各處理下兩種材料的CAT活性發(fā)現(xiàn)，在CK時ZH11的CAT活性顯著大于 NG52（P<0.05），隨著脅迫程度的增加，ZH11和NG52的CAT活性差距逐漸減小，在20A和30A時達到無顯著差異水平。

綜合分析圖 4A、B、C發(fā)現(xiàn)，ZH11和 NG52的SOD活性以及ZH11的POD活性在30A處理下較 20C處理顯著降低（P<0.05），ZH11和 NG52的CAT活性以及NG52的POD活性在30A處理與20C處理相比無顯著差異。

2.5 堿脅迫對水稻葉片還原型抗壞血酸（ASA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量的影響

分析圖5A可知，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的ASA含量（P<0.001），兩者的交互作用對 ZH11和 NG52的 ASA含量具有顯著影響（P<0.001，P<0.001）。ZH11和NG52的ASA含量在30C處理時增至最大，分別較CK增加83.33%和126.95%。比較兩種材料在各個處理下ASA含量發(fā)現(xiàn)，在CK時ZH11的ASA含量顯著大于NG52（P<0.05），隨著脅迫程度的增加，ZH11和 NG52的ASA含量差距逐漸減小，從20B至30C處理時兩種材料的ASA含量無顯著差異。

由圖5B可知，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的GSH含量（P<0.001），兩者的交互作用對NG52的GSH含量具有顯著影響（P<0.001），對ZH11的GSH含量無顯著影響（P=0.056）。ZH11和NG52的GSH含量在30C處理時增至最大，分別較CK增加32.12%和61.61%。分析各個處理下兩種材料的GSH含量發(fā)現(xiàn)，在CK時ZH11的GSH含量顯著大于NG52（P<0.05），但從10A至30C處理時 NG52的 GSH含量顯著大于 ZH11（P<0.05）。

綜合分析圖5A、B發(fā)現(xiàn)，ZH11和NG52的GSH含量以及ZH11的ASA含量在30A處理下較20C處理顯著降低（P<0.05），NG52的ASA含量在30A處理與20C處理相比無顯著差異。

圖5 堿脅迫對水稻葉片ASA和GSH含量的影響Fig. 5 Effects of alkali stress on ASA and GSH contents of rice leaves

2.6 水稻幼苗受害等級的建立

2.6.1 主成分分析及生理參數(shù)的選擇

對所有生理指標(biāo)進行主成分分析（表 2）。在ZH11中提取出1個主成分，特征根為15.787，累計貢獻率為92.867%。在NG52中共提取出2個主成分，第1主成分主要包括Chla、Chlb、Chl、RWC、抗氧化酶、脂質(zhì)過氧化、活性氧、滲透調(diào)劑物質(zhì)、ASA和 GSH，特征根為 14.901，累計貢獻率為87.653%。第 2主成分以 Chla/b為主，特征根為1.321，累計貢獻率為95.422%。因此，兩種材料提取出的主成分均可以描述所有指標(biāo)，但由前文可知，許多指標(biāo)反映結(jié)果相關(guān)性較高、重疊性較大，為簡化計算，綜合各指標(biāo)得分的絕對值，在葉綠素含量、抗氧化酶、脂質(zhì)過氧化、活性氧、滲透調(diào)劑物質(zhì)和非酶類抗氧化物質(zhì)等6類生理指標(biāo)中，挑選Chla、SOD、MDA、H2O2、SS、ASA 作為受害等級劃分的判定依據(jù)。

表2 兩種水稻葉片生理參數(shù)的主成分分析Table 2 Principal component analysis of physiological parameter in rice leaves

2.6.2 已選生理參數(shù)權(quán)重的確定和受害等級構(gòu)建

將Chl a、SOD、MDA、H2O2、SS、ASA等6個指標(biāo)進行極值標(biāo)準(zhǔn)化，然后用熵權(quán)法求得各指標(biāo)權(quán)重如表3所示。

表3 Chla、SOD、MDA、H2O2、SS和ASA的權(quán)重Table 3 Weight coefficient of Chla, SOD, MDA, H2O2, SS and ASA

參考徐超等（2021）的方法引入堿脅迫指數(shù)Z，公式如下：

FCK?F|/FCK)×10

式中：

Z——堿脅迫指數(shù)；

ZA、ZB、ZC、ZD、ZE、ZF——Chl a、SOD、MDA、H2O2、SS、ASA的權(quán)重；

ACK、BCK、CCK、DCK、ECK、FCK——對照下Chl a、SOD、MDA、H2O2、SS、ASA的值；

A、B、C、D、E、F——分別堿脅迫下Chl a、SOD、MDA、H2O2、SS、ASA的值。

根據(jù)上述公式計算出堿脅迫指數(shù)變化規(guī)律如圖6所示，水稻正常生長時，其堿脅迫指數(shù)為0。隨著堿水平和pH的增加，堿脅迫程度逐漸加重。根據(jù)Z值的變化規(guī)律，把水稻受害等級劃分為正常、輕度、中度、重度和特重度 5個脅迫等級。即當(dāng)0≤Z<1為正常水平，當(dāng)1≤Z<4為輕度脅迫，當(dāng)4≤Z<7為中度脅迫，當(dāng)7≤Z<10為重度脅迫，當(dāng)10≤Z為特重度脅迫。

圖6 水稻受害等級的劃分Fig. 6 Classification of injury grades in Rice

根據(jù)上述劃分的等級得出各個處理所對應(yīng)的堿脅迫等級（表4）。對ZH11來說，10A和10B處理為輕度脅迫，10C、20A、20B和 30A處理為中度脅迫，20C和30B處理為重度脅迫，30C處理為特重度脅迫。對NG52來說，10A、10B和10C處理為輕度脅迫，20A、20B、20C和 30A處理為中度脅迫，30B和30C處理為重度脅迫，無特重度脅迫。

表4 堿脅迫指數(shù)在不同處理下的變化規(guī)律Table 4 Changes of alkali stress index with different treatments

3 討論

3.1 不同水稻品種幼苗響應(yīng)堿脅迫的生理差異

鹽堿脅迫引起的滲透脅迫不僅影響葉綠素的合成，同時也加速已合成葉綠素的降解（Huang et al.，2019）。鹽堿脅迫引起的高 pH，破壞了離子穩(wěn)態(tài)，使與葉綠素合成有關(guān)離子如Fe2+、Mg2+、Cu2+等沉淀，進而打破了葉綠素合成與分解的動態(tài)平衡，導(dǎo)致葉綠素含量降低（高立楊等，2020）。葉綠素含量是體現(xiàn)植物光合速率的重要生理參數(shù)（Izadi-Darbandi et al.，2018）。在本研究中，堿脅迫減少了Chl a、Chl b和Chl的含量，并且隨著脅迫程度的增加而顯著降低，這可能是因為堿脅迫降低了葉綠素合成酶的活性，或是破壞了葉綠素的結(jié)構(gòu)使其降解，這與賈旭梅（2019）和 Huang et al.（2019）的研究結(jié)果一致。此外，在堿敏感品種“中花11”中，Chl a/b在脅迫期間整體上呈現(xiàn)下降趨勢；而耐堿品種“寧粳52”的Chl a/b呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這可能是因為在脅迫初期，堿脅迫引起的Chl b含量的下降程度高于Chl a，即Chl a/b的比值增加，隨著脅迫程度的增加，Chl a/b的比值開始降低，可能是不同耐堿材料響應(yīng)堿脅迫的不同生理策略，這與賈婷婷等（2018）在鹽脅迫下沙棗（Elaeagnus angustifolia）中Chl a/b的變化趨勢相同。在本研究中，Chl a和Chl含量以及Chl a/b的比值在30A處理下較20C處理有顯著升高，且在隨后的處理下又開始降低，說明20C處理的脅迫程度大于30A處理，即20C處理對水稻幼苗葉綠素含量的損傷大于30A處理。

相對含水量用于體現(xiàn)植物在不同環(huán)境條件下的含水量和滲透調(diào)節(jié)能力，相對較高的水分含量可以維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（Ravikumar et al.，2014）。滲透脅迫是植物遭受鹽堿脅迫時最先引發(fā)的次級鹽害，積累溶質(zhì)來進行滲透調(diào)節(jié)是緩解鹽堿脅迫的主要途徑；目前，細胞內(nèi)合成的有機溶質(zhì)主要有脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和甜菜堿等（Deinlein et al.，2014）。在本研究中，堿脅迫下兩種水稻葉片相對含水量均有降低，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均持續(xù)增加；其中“中花11”相對含水量降幅大于“寧粳52”，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量的增幅均小于“寧粳52”，可見，耐堿材料是通過積累較多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來減緩含水量的降低，這與曹齊衛(wèi)等（2015）在黃瓜（Cucumis sativus）中的研究結(jié)果類似。此外，水稻葉片相對含水量在30A處理下較20C處理顯著升高，可溶性糖含量在30A處理下較20C處理有顯著降低，說明30A處理對水稻含水量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響大于20C處理。

植物在鹽堿脅迫下，由于氣孔關(guān)閉，葉片內(nèi)CO2濃度降低，導(dǎo)致植物光合作用被抑制，碳同化受阻，為保持光合電子傳遞鏈的正常運行，O2被直接還原為O2·-，最終引起體內(nèi)包括過氧化氫（H2O2），羥基自由基（OH-），超氧自由基（O2·-）和單線性氧（1O2）在內(nèi)的活性氧（ROS）不斷積累（Baxter et al.，2014；Ye et al.，2021）。大量積累的ROS可作用于細胞膜上的蛋白質(zhì)和磷脂雙分子層，致使膜上多聚不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFAs）發(fā)生降解。脂氧合酶（LOX）催化膜上PUFAs的氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜脂過氧化，丙二醛（MDA）是PUFAs過氧化的產(chǎn)物（Doderer et al.，1992）。在本研究中，MDA、LOX和H2O2含量以及O2·-產(chǎn)生速率均隨堿脅迫程度的增加而增加，說明堿脅迫對引起的氧化損傷對水稻的生長產(chǎn)生了影響；堿敏感品種“中花11”MDA、LOX和H2O2含量以及O2·-產(chǎn)生速率增幅大于耐堿品種“寧粳52”，說明耐堿性水稻品種通過降低細胞膜脂質(zhì)過氧化和產(chǎn)生更少的ROS來提高植株的耐堿性，這與Kumar et al.（2020）的研究結(jié)果相似。此外30A處理下的MDA、LOX和H2O2含量以及O2·-產(chǎn)生速率較20C處理顯著降低，說明30A處理下水稻受傷害程度較輕。

植物在清除 ROS的過程中會啟動由多種抗氧化酶和非酶類抗氧化劑組成的抗氧化防御系統(tǒng)，其中酶類的抗氧化劑被認為是清除 ROS最直接、最有效的途徑（Apel et al.，2004），SOD是抵抗ROS的第一道防線。SOD 催化 2O2·-+2H+→H2O2+O2的反應(yīng)，H2O2進一步被POD和CAT分解（Qin et al.，2018；鐘嘉文等，2021）。抗壞血酸（ASA）是主要的抗氧化劑，可以直接淬滅ROS（Tuteja et al.，2010）。在不同的抗氧化反應(yīng)，ASA供給電子并通過清除O2·-和OH-保護植物細胞膜（Hasanuzzaman et al.，2014）。谷胱甘肽（GSH）是另一種重要的抗氧化劑，可以通過谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST）酶清除ROS或有毒化合物，從而提高植物對逆境耐受性（SzalaI et al.，2009）。本研究結(jié)果表明，隨著堿脅迫程度的增加，SOD、POD和CAT活性以及ASA和GSH含量均持續(xù)增加，堿敏感品種“中花11”SOD、POD和CAT活性以及ASA和GSH含量增幅小于耐堿品種“寧粳52”，說明耐堿性水稻品種通過合成更多的抗氧化酶和抗氧劑來清除ROS，進而提高自身的耐受性，Zhang et al.（2017）的研究也得出了相似的結(jié)論。此外，SOD和POD活性以及GSH含量在30A處理時顯著降低，暗示30A處理下植株合成較少的ROS，進而致使SOD和POD活性以及GSH含量相對較低。

3.2 水稻應(yīng)答堿脅迫的階段性變化及受害等級構(gòu)建

安玉艷等（2012）提出植物在應(yīng)對不同程度的逆境脅迫時存在階段性變化，在不同的階段著重點不同。王慧等（2017）研究發(fā)現(xiàn)檉柳（Tamarix chinensis Lour.）總有機碳和營養(yǎng)元素在不同程度的鹽堿脅迫階段差異較大，其中在中度鹽堿脅迫階段總有機碳和全鉀含量最高，及在此階段植株主要通過增加總有機碳和全鉀含量來提高對鹽堿脅迫的適應(yīng)性。本研究通過主成分分析提取6個關(guān)鍵指標(biāo)，將堿脅迫傷害劃分為正常（0≤Z<1）、輕度（1≤Z<4）、中度（4≤Z<7）、重度（7≤Z<10）、特重度（10≤Z）5 個等級。在 10C（10 mmol·L?1、pH 10.50）、20C（20 mmol·L?1、pH 10.50）、30C（30 mmol·L?1、pH 10.50）時，堿敏感水稻ZH11受害等級分別為中度、重度、特重度，而對應(yīng)的耐堿材料NG52受害等級則為輕度、中度、重度。說明不同堿敏感水稻在不同脅迫階段會啟動不同的防御機制，進而影響水稻的抗堿性。在 20C（20 mmol·L?1、pH 10.50）處理下，兩種材料應(yīng)答堿脅迫的差異較大，因此可作為篩選不同堿敏感水稻的閥值。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從10A處理到20C處理階段，葉綠素（Chla、Chlb、Chl）含量、葉綠素 a/b（Chla/b）和葉片相對含水量呈降低趨勢；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（Pro、SS、SP）含量、丙二醛（MDA）含量、脂氧合酶（LOX）活性、活性氧（O2·-和 H2O2）、抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性、還原型抗壞血酸（ASA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量不斷升高。在30A處理下，Chl a和Chl含量以及Chl a/b的比值、葉片相對含水量較20C處理有顯著升高，可溶性糖、MDA、LOX、H2O2、O2·-產(chǎn)生速率、SOD、POD、GSH較20C處理有顯著降低；通過堿脅迫等級的劃分發(fā)現(xiàn)，堿敏感品種“中花11”20C處理下為重度脅迫，30A為中度脅迫，說明中等堿水平（20 mmol·L?1）高 pH（10.50）組合對水稻的傷害大于高堿水平（30 mmol·L?1）低 pH（8.65）組合，即當(dāng)堿水平大于20 mmol·L?1時，堿水平和高pH之間有明顯的相互作用。Zhang et al.（2020）的研究也發(fā)現(xiàn)，在低鹽堿水平下，pH值增加對桑樹（Morus alba）幼苗葉片光系統(tǒng)Ⅱ（photosystem Ⅱ complex，PSⅡ）的影響很小，但是，在高鹽堿水平下，較高的pH值對鹽堿脅迫下PSⅡ反應(yīng)中心的光化學(xué)活性產(chǎn)生較大的影響。

4 結(jié)論

（1）堿脅迫引起水稻各生理參數(shù)的變化，兩種水稻品種在堿脅迫程度下會啟動不同的防御機制以響應(yīng)堿脅迫。耐堿品種“寧粳52”通過保持較高葉綠素含量和葉片相對含水量，以及合成較多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，并提高抗氧化防御系統(tǒng)的能力來清除多余的ROS來增強植株的耐堿性。

（2）運用主成分分析，挑選出 Chla、SOD、MDA、H2O2、SS、ASA等關(guān)鍵指標(biāo)，通過計算脅迫指數(shù)Z，將水稻受害等級劃分為正常（0≤Z<1）、輕度（1≤Z<4）、中度（4≤Z<7）、重度（7≤Z<10）、特重度（10≤Z）5個等級。

（3）在低堿水平（10 mmol·L?1）下，pH 對水稻的生理參數(shù)和脅迫等級影響較小，但在堿水平大于20 mmol·L?1時，堿水平和高pH有明顯的相互作用，對水稻的生理參數(shù)和脅迫等級的影響增大。因此，在鹽堿地種植水稻時應(yīng)考慮總鹽堿水平和 pH共同對水稻生長的影響。