內質網自噬—內質網質量控制新途徑

伍美婷，江俊麟

(中南大學湘雅藥學院藥理學系，湖南 長沙 410078)

內質網(endoplasmic reticulum，ER)是由生物膜構成的片狀囊腔和小管狀腔相互聯通而成。ER是參與細胞內蛋白質合成、折疊，脂質代謝及鈣儲存等的重要細胞器。某些應激狀態，如氧化應激、炎癥、缺氧、鈣代謝紊亂可導致蛋白質未折疊或錯誤折疊，干擾ER穩態，從而引發ER應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。在ERS早期，ER通過啟動未折疊蛋白反應來減少蛋白質翻譯、促進蛋白質折疊及ER相關降解，緩解ER壓力。當細胞發生持續的ERS時，未折疊蛋白反應將導致細胞功能障礙，誘導細胞凋亡。自噬是指受損的細胞器或蛋白質通過溶酶體途徑降解，從而確保細胞內環境穩定的過程。自噬最初被認為是一個非選擇性的過程。新的研究發現自噬過程也具有選擇性，其通過受體蛋白靶向清除細胞內受損的細胞器及蛋白聚合物。作為一種新發現的選擇性自噬，ER自噬被報道在傳染性疾病、癌癥等病變中發揮重要作用。

1 內質網應激

片狀ER主要分布在核周，向內與外核膜連接；管狀ER通常形成網絡狀結構，分布于整個細胞中。根據形態，ER可分為粗面ER和滑面ER。粗面ER表面附著大量核糖體，是蛋白合成與加工的場所；滑面ER表面無核糖體附著，具有解毒、合成脂質、糖原及調節細胞內鈣離子穩態的功能[1]。多種病理性刺激均可引發細胞內環境紊亂，降低ER內蛋白質折疊效率，并導致未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白在ER內大量聚集，最終引起ERS。

ERS主要包括3種反應形式：未折疊蛋白反應(unfold protein response，UPR)、ER超負荷反應(endoplasmic reticulum-overload response，EOR)和固醇調節級聯反應，前兩者是由蛋白質錯誤折疊導致，后者是ER中膽固醇損耗所致。

UPR是研究最為廣泛的信號通路之一，早期ERS通過激活UPR，維持ER穩態并恢復細胞功能。UPR通過調節下游感受器蛋白肌醇需求因子(inositol-requiring enzyme，IRE1)、活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)、類蛋白激酶ER激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)啟動適應性反應，降低mRNA濃度，減少蛋白質翻譯，誘導泛素-蛋白酶體依賴的ER相關降解(ER-associated degeneration，ERAD)及提升分子伴侶(GRP78、GRP94)表達，參與折疊和穩定ER腔內蛋白，恢復ER穩態，最終緩解細胞壓力[2]。當ERS持續高水平存在，UPR將會導致細胞功能障礙，誘導細胞凋亡。

EOR是指正確折疊的蛋白質在ER上過度聚集，激活核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)所致。研究顯示，ER膜蛋白聚集損傷了Ca2+-ATP酶的功能并提高脂質雙分子層對Ca2+的通透性，從而導致大量Ca2+從ER釋放，誘導大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生，后者可誘導NF-κB活化。UPR也可導致EOR。正常情況下，NF-κB與NF-κB抑制蛋白I-κB相互結合形成復合物位于細胞質，抑制NF-κB易位和活化。UPR下游信號中的IRE1α通路可通過降解I-κB，引起NF-κB核易位并使其激活；另一條PERK通路則通過減少I-κB翻譯而激活NF-κB[3]。

固醇調節級聯反應是由膽固醇缺乏引起。當發生ERS時，ER合成的膽固醇耗竭，激活ER膜上的固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)和SREBP裂解激活蛋白(SREBP cleavage activating protein，SCAP)，使其形成復合物并由ER轉移至高爾基體。在高爾基體中SREBP被酶解為活性因子進入細胞核，激活與脂質合成有關基因的轉錄，維持細胞內脂質含量[4]。ERS時間過長或強烈活化可引起級聯反應，導致細胞凋亡。

2 內質網自噬

自噬是細胞的重要保護機制，是通過消除不必要的蛋白質或受損細胞器來維持細胞穩態的分解代謝過程，常在營養缺乏或某些應激下發生。在真核細胞中，自噬分為大自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬。既往研究認為，自噬通過降解細胞內組分來維持細胞的能量代謝和存活，是一個高度保守的非選擇性過程。新的研究表明，在酵母和真核生物細胞中存在選擇性自噬，目的在于降解某些特定底物，如受損的細胞器、蛋白聚集物和入侵的病原微生物等。根據細胞器的不同，可將選擇性自噬分為ER自噬、線粒體自噬、過氧化物酶體自噬及核糖體自噬等。2006年，Bernales等[5]首次在酵母中發現，持續的ERS和UPR可引起針對ER的選擇性自噬，形成只含ER的自噬小體，并將其命名為ER自噬(ER-phagy)。

2.1 內質網自噬的產生ER-phagy是一條新的ER質量控制途徑。正常情況下ER-phagy保持在一個較低水平以維持ER穩態。當機體受到刺激，如營養匱乏、病原體感染時，蛋白酶體途徑無法降解ER內大量堆積的蛋白質，ER-phagy則作為一個“補償”機制來恢復ER功能[6]。根據作用方式的不同，ER-phagy可分為內質網巨自噬(macro-ER-phagy)、內質網微自噬(micro-ER-phagy)和小泡吞飲內質網自噬(vesicular delivery)。macro-ER-phagy大致可分為4個步驟：①ER上的自噬受體通過其LC3相互作用結構域/Atg8相互作用結構域/GABARAP相互作用結構域與自噬雙層膜相互作用，形成碎片并從ER上脫離；②自噬雙層膜延伸將ER片段包裹成新的自噬小體；③自噬小體與溶酶體融合；④自噬小體被溶酶體酶降解(Fig 1)。ER微自噬是指溶酶體直接通過內吞的形式，將ER包裹進入溶酶體腔內降解的過程。小泡吞飲介導的ER自噬是指未折疊蛋白聚集物形成小泡從ER上脫落，進一步被溶酶體捕獲并降解。目前，ER巨自噬是報道最為廣泛的一類ER-phagy。

Fig 1 Macro-ER-phagy process

2.2 內質網自噬的作用作為一條新發現的ER質量控制途徑，ER-phagy具有雙重作用：一是在持續的ERS過程中，ER-phagy有利于隔離無法發揮正常功能的ER或是大量不能通過其他方式處理的錯誤折疊蛋白；二是在ERS減弱時，ER-phagy可減少膨脹的ER，使之形態恢復正常。

2.3 內質網自噬受體ER-phagy是由ER上的自噬受體介導的。研究發現，在酵母中存在2種ER-phagy受體，分別是Atg39和Atg40。在哺乳動物細胞ER膜上存在6種受體，分別是序列相似性家族134B(family with sequence similarity 134 member B，FAM134B)、漿膜蛋白3長剪切體(reticulon 3，RNT3L)、ATL3(atlastins 3)、分泌轉運蛋白62(secretory translocation protein，SEC62)、細胞周期進程基因1(cell-cycle progression gene 1，CCPG1)和睪丸表達基因264(testis expressed gene 264，TEX264)(Fig 2)。ER-phagy受體主要有兩個作用，一是識別需被降解的ER或ER腔內的未折疊蛋白，二是通過Atg8相互作用結構域(Atg8-interacting motif，AIM)或LC3相互作用結構域(LC3-interacting region，LIR)與自噬相關蛋白Atg8/LC3/GABARAP結合介導自噬體形成。

Fig 2 ER-phagy related receptors

2.3.1酵母內質網自噬受體 在酵母中，氮缺乏和雷帕霉素誘導的ER-phagy是由ER自噬受體Atg39和Atg40介導。作為Atg8結合蛋白，Atg39和Atg40均包含一個AIM，促進其與自噬膜上的Atg8結合。Atg39屬單跨膜蛋白，定位于核周ER，主要參與核周ER的清除；Atg40包含一個與哺乳動物ER同源結構域(reticulon-homology domain，RHD)類似的結構，其對ER片段的脫落及ER膜的形態修復具有重要作用，主要參與皮層ER的清除[7]。由Atg39和Atg40介導的ER-phagy需Atg1、Atg8、 Atg11和Atg17的參與[7]。

2.3.2哺乳動物細胞內質網自噬受體

2.3.2.1 FAM134B FAM134B是首個發現的哺乳動物ER自噬受體，也是現今研究最為廣泛的ER自噬受體。最初，FAM134B被認為是高爾基上的特定蛋白，主要參與感覺和自主神經病變的發病[8]。隨后研究發現FAM134B包含一個RHD和LIR，其RHD能促進ER彎曲和片段形成，LIR能夠錨定自噬泡上LC3/GABARAP，因此FAM134B被認為是一種ER自噬受體蛋白[9]。FAM134B可參與抵抗ERS，維持細胞內環境穩態。研究顯示，在FAM134B敲低的U2OS細胞、FAM134B敲除的小鼠胚胎成纖維細胞或FAM134B下調的人胚腎293細胞，ER出現明顯擴增，而過表達FAM134B可使ER片段增多并促進溶酶體降解[8]。除降解ER片段外，FAM134B還參與維持蛋白穩態。在人骨肉瘤細胞和小鼠胚胎成纖維細胞中，FAM134B可與ER膜上的鈣連蛋白結合，識別錯誤折疊的原膠原后，啟動ER-phagy將其清除[10]。

2.3.2.2 RTN3L RTN3是高度富集于管狀ER中的一種彎曲膜蛋白。RTN3含有RTN3L和RTN3S 2種剪切體，其中RTN3L為ER-phagy受體。RTN3L的N末端包含6個LIR，能夠與LC3/GABARAP結合。RTN3L以單體和多聚體形式存在。單體形式的RTN3L參與維持管狀ER的形態；RTN3L多聚體則促進含RTN1、RTN4、REEP5和RTN3的管狀ER彎曲變形，并通過LIR與LC3/GABARAP結合并包裹成自噬小體[11]。研究顯示，氨基酸過度消耗，可激活RTN3L，啟動ER-phagy。在RTN3-/-的小鼠胚胎成纖維細胞中，饑餓介導的相關管狀ER蛋白的重塑受到影響。有趣的是，在RTN3-/-小鼠，ER并沒有出現功能缺陷[12]。因此，RTN3是否參與ER-phagy調控有待進一步研究。

2.3.2.3 ATL3 ATL3是具有ER跨膜結構域的ER-phagy受體。與其他哺乳動物受體不同，ATL3的LIRs并不位于一個固有的無序區域，而是存在于一個胞質內的N端動態蛋白樣GTPase結構域內。ATL3含有2個非經典的LIR即GABARAP相互作用模塊(GABARAP interacting motifs，GIMs)，其通過與GABARAP結合來促進ER-phagy，清除受損的管狀ER[13]。ATL3通常以二聚化的形式來調節ER出口位點的豐度。研究證實，在哺乳動物ATLs家族蛋白中，ATL1、ATL2、和ATL3具有高度的同源序列。在ATL2敲除的HCT116細胞中，重新表達上述任何一個ATLs cDNA都可恢復饑餓誘導的ER-phagy。免疫共沉淀結果進一步顯示，ATL2與ATL3可通過GTP酶結構域相互作用，提示ATL2可能與ATL3形成異源二聚體，介導ER-phagy[14]。此外，Chen等[15]研究發現，ATL3的Y192C和P338R突變可抑制ATL3與GABARAP結合，削弱ATL3介導的ER-phagy，并誘導I型遺傳性感覺和自主神經病變(hereditary sensory and autonomic neuropathy type I，HSAN I)。

2.3.2.4 SEC62 SEC62是粗面ER轉運復合物SEC61/SEC62/SEC63中的一個跨膜蛋白，主要參與富含UPR上調相關分子伴侶和折疊酶(如鈣連蛋白、鈣網蛋白、ERp72和 ERp57等)的ER片段清除。當UPR處于正常水平時，SEC63與LC3競爭性地結合SEC62，并與SEC61形成復合體，參與介導新合成的前體多肽轉運至ER[16]。與FAM134B等自噬受體介導的ER-phagy不同，SEC62介導恢復性ER自噬，即ERS被解除后，SEC62通過其C端的LIR介導恢復性ER-phagy，恢復ER穩態。SEC62與癌癥如肺腺癌、前列腺癌等的發生發展相關。在非小細胞肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌等癌細胞中，SEC62呈現高表達，進而增加其LIR與LC3/GABARAP結合的敏感性，促進受損ER清除，導致腫瘤對ERS耐受及腫瘤耐藥性增加[17]。

2.3.2.5 CCPG1 CCPG1是非經典的ER自噬受體。CCPG1主要分布在核周ER，是唯一一個N端同時含有1個LIR和2個FIP200互作結構域(FIP200-interatcting regions，FIRs)的ER-phagy受體。FIRs與酵母ER自噬受體Atg39上的Atg11結合模塊有較高的相似性，CCPG1可能通過其N端的FIR與FIP200作用結合，招募ULK1復合物，加強細胞對自噬信號的募集[18]。ERS發生時，激活的CCPG1通過C端與受損的ER及腔內聚集的蛋白連接，使CCPG1其從ER上脫離，促進其被新生成的自噬小泡包裹。在小鼠胰腺，由CCPG1介導的ER-phagy能夠減少ER腔內蛋白聚集和UPR，維持胰腺腺泡細胞內蛋白穩態，而CCPG1缺失可導致ER中大量酶原蛋白堆積，促進細胞死亡，最終導致胰腺炎[19]。

2.3.2.6 TEX264 TEX264是含有單跨膜結構的ER-phagy受體蛋白，在其C末端含有1個LIR和由113個氨基酸構成的動態固有無序區域(intrinsically disordered region，IDR)，后者環繞LIR，可避免LIR受空間位阻的影響，有利于LIR與自噬膜的連接。饑餓條件下，細胞內大部分ER-phagy是由TEX264介導[20]。相比于上述5個ER-phagy受體，TEX264在多個器官中呈高表達，且廣泛分布于ER膜上。此外，TEX264與LC3/GABARAP家族蛋白結合效率更高且更牢固，其原因可能是由于TEX264主要表達于ER三口連接處，而自噬體膜正是在ER三口連接處形成。研究顯示，在Hela細胞，分別敲除6種不同的ER-phagy受體(FAM134B、RNT3L、ATL3、SEC62、CCPG1和TEX264)，當敲除TEX264時，對ER-phagy影響最明顯，而同時敲除TEX264、FAM134B和CCPG1將進一步損害ER-phagy，提示TEX264可能是介導ER-phagy的主要受體[21]。

2.3.2.7 其他 除上述ER膜上的ER-phagy受體外，研究發現p62、胞質蛋白CALCOCO1及胞質C53也可能參與介導ER-phagy。在TCPOBOP處理的小鼠，p62可將LC3-Ⅱ陽性的自噬體招募到泛素-p62修飾的ER，啟動ER-phagy，介導肝臟受損ER的清除。與野生型小鼠相比，敲除p62敲除后，小鼠肝臟ER出現膨脹和體積增大[22]。在饑餓誘導的ERS中，胞質蛋白CALCOCO1可作為可溶形ER-phagy自噬受體，其通過FFAT樣結構域與管狀ER蛋白VAPA/B作用，并通過其UIR或者LIR相互作用結構域與Atg8家族蛋白相互作用，介導管狀ER-phagy發生[23]。在共翻譯蛋白轉運過程中核糖體發生停滯時，胞質蛋白C53可通過感受ER蛋白質毒性，與ER相關泛素折疊修飾連接酶UFL1及ER膜受體DDRGK1形成復合物，后者被ER上滯留的核糖體激活，并暴露C53上的非典型ATG8相互作用元件使其與ATG8相互作用招募自噬小體，導致特異性ER蛋白的降解[24]。

3 內質網自噬與疾病

ER-phagy是參與調控ER功能的主要方式之一，能有效清除細胞內受損的ER和錯誤的蛋白聚集體，維持細胞內環境穩定。研究顯示，在一些傳染性疾病、癌癥、神經退行性疾病、糖尿病等疾病中，ER-phagy水平會發生改變，過度激活或抑制ER-phagy可導致細胞內受損ER和錯誤蛋白聚集體清除障礙，使機體病變加劇。

在病毒和細菌的感染周期中，ER-phagy被認為是宿主細胞的重要防御機制，能夠清除ER中的細菌或病毒。Chiremel等[25]發現，ER-phagy可抑制埃博拉病毒在小鼠胚胎成纖維細胞中的復制，而敲除FAM134B后病毒的復制能力明顯增強，表現為VP40蛋白和核蛋白表達的增加。另一ER-phagy受體RTN3通過與丙型肝炎病毒的非結構蛋白NS4B的AH2結構域競爭性結合，抑制AH2自身寡聚化，抑制病毒復制[26]。病毒也可通過某些機制逃避宿主的ER-phagy。例如，丙型肝炎病毒蛋白酶NS3可通過破壞FAM134B的RHD結構域，削弱FAM134B介導的ER-phagy[27]。提示ER-phagy可能成為治療傳染性疾病的新靶點。

近期研究發現，ER-phagy受體FAM134B、SEC62參與多種癌癥的發生發展。在食管鱗狀細胞癌和肝細胞癌中，FAM134B作為促癌因子，通過激活Akt來促進細胞增殖和遷移；而在結腸癌和乳腺癌中，FAM134B則發揮抑癌作用[28]。SEC62在多種癌細胞如前列腺癌、甲狀腺癌細胞中呈高表達，通過啟動ER-phagy緩解ERS引起的細胞損傷，進而促進癌細胞生長[17]。

C型尼曼皮克病是一種神經退行性病變，主要是由編碼NPC1的基因(1061位點異亮氨酸-蘇氨酸)突變引起，該突變可影響跨膜糖蛋白折疊，導致細胞內未酯化膽固醇堆積。研究發現，低表達FAM134B可增加突變型NPC1蛋白含量，而過表達FAM134B可啟動ER-phagy，減少突變型NPC1蛋白聚集，抑制細胞內未酯化膽固醇堆積[29]，提示干預ER-phagy可能成為治療C型尼曼皮克病的新方法。

胰島素基因突變所導致的青少年糖尿病(mutant INS-gene-induced diabetes of youth，MIDY)是一種Akita胰島素原基因突變型糖尿病，主要是由Akita胰島素原基因突變致使胰島素原不能正確折疊，阻止正常胰島素原加工為成熟胰島素所引起。Cunningham等[30]發現敲除RTN3可增加突變型胰島素原聚集物的堆積，而過表達RTN3可通過激活ER-phagy，清除突變型胰島素原聚集物，恢復ER功能，促進胰島素產生，提示靶向ER-phagy可能成為治療MIDY的有效途徑。

4 小結

到目前為止，已發現多種不同類型的ER自噬受體，即Atg39、Atg40、FAM134B、RTN3L、ATL3、SEC62、CCPG1和TEX264，進一步豐富了人們對ER-phagy的認識。ER-phagy是一把雙刃劍，適度的ER-phagy可降解錯誤/未折疊的蛋白質及受損的ER，維持細胞穩態；而過度激活的ER-phagy又能引起細胞死亡。因此，針對不同疾病模型，以ER-phagy受體為疾病治療靶點進行深入研究，闡明其調控過度激活/抑制的ER-phagy的具體機制，也有望為相關疾病的治療提供新思路。