甘草素通過(guò)調(diào)控miR-216b-5p對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖凋亡及化療敏感性的作用研究

陳鈺龍，王華啟，張莉蓉

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.藥學(xué)部、2.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000)

肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類型，目前盡管臨床對(duì)其治療取得一定進(jìn)展，但晚期患者預(yù)后仍較差，病死率高[1]。以順鉑為主藥物化療為肺腺癌主要治療手段之一，但也較易復(fù)發(fā)，腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑藥物耐藥性已逐漸成為影響患者化療效果及預(yù)后的關(guān)鍵因素，目前尚無(wú)可逆轉(zhuǎn)化療多藥耐藥有效方法[2]。甘草為中醫(yī)常用藥材之一，其活性成分甘草素能對(duì)腫瘤細(xì)胞血管生成進(jìn)行抑制，阻滯細(xì)胞周期，影響腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖基因調(diào)控，具有潛在藥用價(jià)值[3]。研究還發(fā)現(xiàn)[4]，甘草素可經(jīng)調(diào)節(jié)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞自噬，增強(qiáng)放療敏感性。王勇等[5]還提出，甘草素抑制肺癌細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)放療敏感性的機(jī)制可能與調(diào)控WIG-1基因表達(dá)有關(guān)，但就其他機(jī)制尚未具體明確。微小RNA(microRNA，miR)-216b-5p為miR-216家族成員之一，是一種腫瘤抑制因子，在多種腫瘤組織中表達(dá)降低，且參與相應(yīng)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程，目前臨床就其在肺腺癌腫瘤細(xì)胞增殖凋亡以及化療敏感性中作用研究較少。基于此，本研究開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)分析了甘草素對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖凋亡及化療敏感性的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人肺腺癌H1299細(xì)胞株購(gòu)自上海通派生物科技公司。

1.1.2主要試劑、儀器 甘草素(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：S05167)，順鉑(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：181026)，10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：R6081)，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：S10262)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)，甲基噻唑基四唑(Methylthiazolyltetrazolium，MTT)比色法試劑盒(美國(guó)BioVision公司)，微小核糖核酸-216b-5p(microRNA-216b-5p，miR-126b-5p)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)試劑盒(湖北武漢富鑫遠(yuǎn)科技有限公司)，兔抗人mTOR、磷酸化-mTOR(phosphorylated-mTOR，p-mTOR)、Bcl-2、β-actin一抗及山羊抗兔IgG二抗(美國(guó)Abcam公司)。ELx800型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)，AS-90型流式細(xì)胞儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)，BX43顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)，數(shù)字圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)通用公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù) 人肺腺癌H1299細(xì)胞株置于含10%胎牛血清、1%青霉素及1%鏈霉素DMEM培養(yǎng)基，放置在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%，每隔2 d，以0.25%胰蛋白酶消化傳代一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H1299細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)至1.0×107個(gè)·L-1，在96孔板內(nèi)接種，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁，去除舊培養(yǎng)液。甘草素使用前以生理鹽水溶解成終濃度10.0 mg·L-1溶液。甘草素設(shè)10、20、40、60、80 mg·L-15個(gè)濃度組，另設(shè)對(duì)照組(加50 μL/孔，不含甘草素培養(yǎng)液)，處理24 h后收集全部細(xì)胞。

1.2.2化療敏感性檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)。取1.2.1中各組細(xì)胞，96孔板內(nèi)接種，各組復(fù)孔數(shù)均為5。待細(xì)胞貼壁，以不同濃度(0.625、1.25、2.5、5、10 mg·L-1)順鉑干預(yù)各組細(xì)胞，另設(shè)空白孔，僅加200 μL培養(yǎng)液。各組細(xì)胞處理24 h后，加5 μL CCK-8，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，共4 h。各孔加含0.1% DMSO的DMEM溶液，振蕩10 min。觀察結(jié)晶溶解后，置于酶標(biāo)儀檢測(cè)。記錄酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處吸光度(absorbance，A)值，計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)=(實(shí)驗(yàn)孔A值/空白孔A值)×100%，評(píng)估化療敏感性。

1.2.3細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 采用MTT比色法檢測(cè)。取“1.2.1”中各組細(xì)胞，接種于96孔板，觀察細(xì)胞貼壁后，以最接近IC50值濃度2.5 mg·L-1順鉑干預(yù)各組細(xì)胞24 h。各孔加5 g·L-1MTT液20 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)。完成培養(yǎng)后，800 r·min-1離心，離心半徑10 cm，10 min，棄上清液。分別在各孔加標(biāo)準(zhǔn)濃度DMSO溶液200 μL，震蕩10 min，混勻。觀察細(xì)胞內(nèi)紫藍(lán)色結(jié)晶溶解后，置于酶標(biāo)儀檢測(cè)。記錄酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處A值，評(píng)估細(xì)胞增殖活性。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取“1.2.1”中各組細(xì)胞，接種于96孔板，觀察細(xì)胞貼壁后，以2.5 mg·L-1順鉑干預(yù)各組細(xì)胞24 h。各孔加不含EDTA胰酶消化，細(xì)胞以EP管收集，磷酸鹽緩沖液沖洗2次。各管加1× binding buffer 200 μL，重懸細(xì)胞，再以Annexin V-PE 5 μL加入細(xì)胞重懸液內(nèi)，混勻，室溫，避光孵育10 min。各管加7-AAD 5 μL，吹打，混勻。4 h內(nèi)，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率/%=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.5miR-216b-5p、mTOR、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用RT-qPCR法檢測(cè)。取“1.2.1”中各組細(xì)胞，接種于96孔板，觀察細(xì)胞貼壁后，以2.5 mg·L-1順鉑干預(yù)24 h，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。以TRIzol試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)Tab 1。反應(yīng)條件：94 ℃，5 min，預(yù)變性；94 ℃，35 s，變性；58 ℃，35 s，退火；72 ℃，35 s，延伸，共35次循環(huán)。以2-△△CT法計(jì)算miR-216b-5p、mTOR、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6mTOR、p-mTOR、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。取“1.2.1”中各組細(xì)胞，接種于96孔板，觀察細(xì)胞貼壁后，以2.5 mg·L-1順鉑干預(yù)24 h，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。各組加100 μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解，提取細(xì)胞總蛋白。4 ℃，12 000 r·min-1離心，離心半徑10 cm，10 min，取上清液。BCA蛋白試劑定量檢測(cè)蛋白，沸水浴變性10 min，冰上冷卻10 min。各泳道分別加20 μL總蛋白樣品，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。加mTOR、p-mTOR、Bcl-2、β-actin(1 ∶1 000)一抗，搖床孵育過(guò)夜。TBST液清洗，重復(fù)3次，每次10 min。加二抗(1 ∶3 000)，室溫孵育2 h。TBST液清洗，重復(fù)3次，每次10 min。加ECL試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值比值表示。

2 結(jié)果

2.1 化療敏感性各組IC50值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，甘草素10、20、40、60、80 mg·L-1組IC50值降低，且甘草素80 mg·L-1組<甘草素60 mg·L-1組<甘草素40 mg·L-1組<甘草素20 mg·L-1組<甘草素10 mg·L-1組(P<0.05)。見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Comparison of IC50 values in each group

2.2 細(xì)胞增殖能力各組MTT實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，甘草素10、20、40、60、80 mg·L-1組MTT實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖活性升高，且甘草素10 mg·L-1組<甘草素20 mg·L-1組<甘草素40 mg·L-1組<甘草素60 mg·L-1組<甘草素80 mg·L-1組(P<0.05)。見(jiàn)Tab 3。

Tab 3 Comparison of experimental A MTT cells in each group

2.3 細(xì)胞凋亡各組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，甘草素10、20、40、60、80 mg·L-1組細(xì)胞凋亡率升高，且甘草素10 mg·L-1組<甘草素20 mg·L-1組<甘草素40 mg·L-1組<甘草素60 mg·L-1組<甘草素80 mg·L-1組(P<0.05)。見(jiàn)Fig 1、Tab 4。

Fig 1 Comparison of apoptosis in each group detected by flow cytometry

Tab 4 Comparison of apoptotic rate in each group

2.4 miR-216b-5p、mTOR、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量各組miR-216b-5p、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，甘草素10、20、40、60、80 mg·L-1組miR-216b-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，且miR-216b-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量，甘草素10 mg·L-1組<甘草素20 mg·L-1組<甘草素40 mg·L-1組<甘草素60 mg·L-1組<甘草素80 mg·L-1組，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量，甘草素80 mg·L-1組<甘草素60 mg·L-1組<甘草素40 mg·L-1組<甘草素20 mg·L-1組<甘草素10 mg·L-1組(P<0.05)。見(jiàn)Tab 5。

2.5 mTOR、p-mTOR、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量各組p-mTOR、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，甘草素10、20、40、60、80 mg·L-1組p-mTOR、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，且甘草素80 mg·L-1組<甘草素60 mg·L-1組<甘草素40 mg·L-1組<甘草素20 mg·L-1組<甘草素10 mg·L-1組(P<0.05)。見(jiàn)Fig 2、Tab 6。

Fig 2 Protein expression of mTOR, p-mTOR and Bcl-2 in each group

Tab 6 Comparison of relative expression of mTOR, p-mTOR and Bcl-2 protein in each group

3 討論

肺腺癌在臨床上較為常見(jiàn)，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，化療、放療及綜合治療等保守治療仍無(wú)法有效挽救生命，而腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是保守治療無(wú)效主要原因之一。肺腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥的機(jī)制較為復(fù)雜，包括細(xì)胞異常凋亡、細(xì)胞膜內(nèi)酶系統(tǒng)異常、DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)增強(qiáng)、細(xì)胞自噬等[6]。因此，臨床采取有效措施提升肺腺癌患者化療敏感性，以控制病情，改善治療效果、預(yù)后，具有重要意義。近年來(lái)，單味中藥及中藥活性成分的應(yīng)用已逐漸成為抗腫瘤研究領(lǐng)域熱點(diǎn)之一，在腫瘤治療方面具有多途徑、多靶點(diǎn)及多效性特點(diǎn)，前景廣闊[7]。

甘草為常見(jiàn)中草藥之一，具有平陽(yáng)秘、旺氣血、寬經(jīng)脈等作用，其有效成分甘草素還具有抗腫瘤的藥理作用[8]。報(bào)道顯示[9]，甘草素且可經(jīng)細(xì)胞色素C、Bcl-2家族等多種途徑，參與腫瘤細(xì)胞凋亡、自噬過(guò)程。王宇[10]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，甘草素能對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞遷移進(jìn)行抑制，且作用機(jī)制可能與阻礙磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路有關(guān)。但目前，臨床就甘草素對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖凋亡及化療敏感性影響及機(jī)制尚無(wú)明確定論。本研究結(jié)果顯示，隨甘草素應(yīng)用濃度增加，人肺腺癌H1299細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)A值升高，這提示甘草素對(duì)人肺腺癌H1299細(xì)胞增殖有一定抑制作用，且抑制作用隨濃度增加而逐漸增強(qiáng)。另外，甘草素應(yīng)用后H1299細(xì)胞凋亡率升高，IC50值降低，這提示甘草素還可促進(jìn)H1299細(xì)胞凋亡，提升化療敏感性，效果呈劑量依賴性。

miRNA是一種短鏈非編碼RNA分子，可經(jīng)由結(jié)合靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)一些特異性序列，對(duì)靶基因mRNA進(jìn)行降解，調(diào)控基因表達(dá)[11]。其中，miR-216可抑制非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖、侵襲能力[12]。秦巧紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-216b-5p存在低表達(dá)，且能對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力進(jìn)行抑制，可能成為腫瘤治療潛在靶點(diǎn)。還有學(xué)者提出[14]，miR-216b-5p表達(dá)上調(diào)可逆轉(zhuǎn)人前列腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥性，提升化療敏感性。另外，miR-216b-5p可介導(dǎo)mTOR通路，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及治療過(guò)程[15]。mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、生殖、凋亡及血管內(nèi)皮再生等生理過(guò)程。報(bào)道顯示[16]，多種腫瘤細(xì)胞中存在抑癌基因磷酸酶與張力蛋白同源基因突變、缺失，可最終導(dǎo)致mTOR信號(hào)通路激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移，增加腫瘤細(xì)胞抗凋亡效應(yīng)，在邏輯上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥發(fā)生。Bcl-2是一種凋亡調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)[17]，Bcl-2在TP53野生型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中可對(duì)mTORC1/2抑制劑耐藥。張艷等[18]也發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR通路可增強(qiáng)宮頸癌紫杉醇耐藥株對(duì)紫杉醇敏感性。這些研究均提示，miR-216b-5p介導(dǎo)的mTOR信號(hào)通路可能在肺腺癌疾病控制中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，甘草素應(yīng)用后miR-216b-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量提升，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量及p-mTOR、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，且呈劑量依賴性，提示甘草素可上調(diào)miR-216b-5p表達(dá)，抑制mTOR信號(hào)通路，這可能是甘草素發(fā)揮抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及提升化療敏感性的重要作用機(jī)制之一。

綜上所述，甘草素可抑制人肺腺癌H1299細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提升化療敏感性，作用機(jī)制可能與上調(diào)miR-216b-5p表達(dá)、抑制mTOR信號(hào)通路有關(guān)。本研究不足之處在于僅分析了甘草素經(jīng)調(diào)控miR-216b-5p表達(dá)介導(dǎo)mTOR信號(hào)通路的作用，未就其他途徑進(jìn)行分析，而甘草素影響肺腺癌細(xì)胞增殖凋亡及化療敏感性途徑較多，故今后仍需進(jìn)一步分析。