王不留行黃酮苷對小鼠動脈粥樣硬化的作用及機制

馬欣雨，徐 非，龔蕾蕾，程蕊棠，繆孫涵，朱雨薇，蔡維維，侯 豹，邱麗穎

(江南大學無錫醫學院, 江蘇 無錫 214122)

1 前言

動脈粥樣硬化是一種常見的心血管疾病，發病率高、致死率高，極易發展成腦卒中、冠心病等心血管病變，嚴重威脅人類健康，導致其病發的危險因素復雜多樣包括性別、年齡、血壓等[1-2]。纖維和脂肪的堆積是動脈粥樣硬化的主要表現，可使動脈管腔變窄、彈性降低，一旦發展到阻塞動脈管腔，則可導致該動脈供應的組織或器官缺血、壞死，嚴重影響機體功能。動脈粥樣硬化病理機制復雜，但其主要原因之一是血管內皮受損[3-4]。因此，治療動脈粥樣硬化的靶點之一可能是改善內皮功能。實驗室多年的研究發現，王不留行黃酮苷(vaccarin)能夠改善高糖誘導的內皮細胞凋亡[5]，促進內皮細胞增殖，從而發揮保護內皮的作用[6]。此外，其對心血管重構、腎病以及腎性高血壓大鼠的血壓具有改善作用[7]。既往的研究結果表明vaccarin在改善心血管功能中的重要作用，因此本研究將進一步探究vaccarin在小鼠動脈粥樣硬化模型中的作用及相關分子機制。

2 材料和方法

2.1 主要藥品與試劑王不留行黃酮苷(上海士峰科技有限公司)；高脂飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)； 油紅O染料，DCFH-DA探針試劑盒(上海索萊寶科技有限公司)；Masson染色試劑盒，總膽固醇試劑盒，甘油三酯試劑盒，高密度脂蛋白膽固醇試劑盒，低密度脂蛋白膽固醇試劑盒，蘇木素伊紅染色試劑盒(南京建成生物有限公司)；小鼠MCP-1、IL-6、ICAM-1、VCAM-1 ELISA試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；兔抗p38 MAPK抗體，兔抗p65-NFkB抗體，兔抗SM22a抗體，兔抗β-actin抗體，羊抗兔IgGH&L (Alexa Fluor@ 488)抗體，鼠抗Bcl-2抗體，兔抗Caspase-3抗體，兔抗Bax抗體(英國Abcam公司)。

2.2 實驗動物本實驗所用小鼠，購自南京大學模式動物研究所，為雄性6-8周齡的AopE-/-和C57BL/6J小鼠。空白對照組(WT)與王不留行黃酮苷對照組(WT+Vaccarin)選取C57BL/6J小鼠，正常飼料喂養20周；動脈粥樣硬化模型組(ApoE-/-+HFD)組與王不留行黃酮苷治療組(ApoE-/-+HFD+Vaccarin)則選取AopE-/-小鼠聯合高脂飼料喂養20周構建小鼠模型。在第16周時ApoE-/-+HFD+Vaccarin組與WT+Vaccarin組每日腹腔注射vaccarin(1 mg·kg-1)，持續4周；另外兩組則注射等量生理鹽水。所有動物實驗是在江南大學實驗動物委員會的批準下進行，動物倫理編號：JN.No 20201130t1280301[327]。

2.3 血清脂質含量測定小鼠禁食不禁水12 h后，戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射，麻醉小鼠后眼球取血，2 500 r·min-1離心20 min后吸取上層血清。按一定比例稀釋血清后，檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。

2.4 油紅O染色檢測血管脂質沉積小鼠處死后，取血管以及主動脈根部制作冰凍切片后使用冷凍切片機切片，厚度為10 μm。根據試劑盒說明進行油紅O染色。

2.5 ELISA法測定血清炎癥因子水平取小鼠血清，檢測炎癥因子IL-6，ICAM-1，MCP-1和VCAM-1的水平，按照ELISA試劑盒說明，將稀釋好的樣品以及標準品加入酶標板中，并設空白孔進行對照，加入抗體孵育、洗滌后加入顯色液進行反應20 min后加入終止液，采用酶標儀檢測OD值，繪制標準曲線，計算樣品濃度。

3 結果

3.1 王不留行黃酮苷對ApoE-/-小鼠血糖、血壓、體質量的影響與WT小鼠相比，ApoE-/-+HFD小鼠血糖、血壓以及體質量均明顯上升而腹腔注射vaccarin后，升高的血糖、血壓、體質量，出現顯著降低現象。另外，WT+Vaccarin組與WT小鼠相比沒有血糖、血壓和體質量的改變(Tab 1)。上述結果表明，腹腔注射vaccarin可以改善動脈粥樣硬化模型小鼠血糖、血壓以及體質量。

3.2 王不留行黃酮苷改善ApoE-/-小鼠主動脈的粥樣硬化斑塊及纖維化的形成油紅O染色檢測結果表明，WT+Vaccarin組小鼠與WT組相比，主動脈及其根部處無斑塊形成。ApoE-/-+HFD+Vaccarin組小鼠與ApoE-/-+HFD組小鼠相比，主動脈斑塊面積明顯減少，而主動脈根部斑塊面積無改變(Fig 1 A, B, D)。另外，Masson染色表明，WT +Vaccarin組與WT組小鼠主動脈均無病變，而ApoE-/-+HFD小鼠主動脈斑塊纖維化顯著增多，而vaccarin則可緩解纖維化程度(Fig 1 C,D)。Western blot結果同樣表明，WT+Vaccarin組與WT組的小鼠相比SM22α的表達無明顯變化；而ApoE-/-+HFD組表達明顯增加，vaccarin治療后可明顯降低SM22α的表達(Fig 1 E, F)。以上表明，vaccarin可降低ApoE-/-+HFD小鼠動脈粥樣硬化斑塊的纖維化程度。

3.3 王不留行黃酮苷改善ApoE-/-小鼠血脂代謝及主動脈炎癥脂代謝障礙是動脈粥樣硬化的重要原因，主要表現為血脂膽固醇含量的升高[8]。實驗結果表明，與WT組相比，ApoE-/-+HFD組小鼠血清中TG、TC、LDL-C的水平明顯升高，HDL-C明顯降低。ApoE-/-+HFD+Vaccarin組與ApoE-/-+HFD組小鼠相比，TG、TC、LDL-C的水平明顯降低，HDL-C明顯升高(Fig 2A)。此外，主動脈內皮炎癥作為血管內皮損傷的因素之一，在動脈粥樣硬化進展中發揮了重要作用[9]。因此，我們深入探究了vaccarin對ApoE-/-小鼠炎癥的影響。小鼠主動脈qRT-PCR結果顯示，IL-6，MCP-1，ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平在WT+Vaccarin組小鼠的主動脈內無明顯變化。在高脂飼料喂養的ApoE-/-+HFD小鼠體內則明顯上升，此基礎上，注射vaccarin后，IL-6，MCP-1，ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平可出現明顯下降(Fig 2 B)。同樣，ELISA 結果顯示，vaccarin抑制ApoE-/-+HFD小鼠黏附因子水平的升高(Fig 2 C)。免疫印跡結果顯示，ApoE-/-+HFD小鼠胞核NFκB p65可見明顯升高。ApoE-/-+HFD+Vaccarin組中，胞核NFκB p65可見明顯下降(Fig 2 D, E)。以上表明，vaccarin可改善動脈粥樣硬化小鼠的炎癥水平。

3.4 王不留行黃酮苷影響ApoE-/-小鼠主動脈內皮細胞的凋亡Caspase-3活性檢測顯示，與WT小鼠相比，WT+Vaccarin組小鼠caspase-3活性沒有改變，ApoE-/-+HFD組小鼠caspase-3活性明顯升高而vaccarin干預后明顯降低(Fig 3 C)。免疫印跡結果同樣表明，與WT相比，WT+Vaccarin組小鼠caspase-3的切割(c-caspasse-3)、Bcl-2及Bax蛋白水平無明顯變化。ApoE-/-+HFD組小鼠的c-caspasse-3及Bcl-2的表達水平升高，抑凋亡蛋白Bax的表達水平下降。Vaccarin干預后，則觀察到相反的現象(Fig 3 A, B)。上述結果表明，vaccarin可改善ApoE-/-小鼠主動脈血管內皮細胞的凋亡。

Fig 3 Effect of Vaccarin on apoptosis in ApoE-/-+HFDmice fed with high-fat diet n=3)

3.5 王不留行黃酮苷對ApoE-/-小鼠血管內皮損傷減輕的機制ROS、p38 MAPK參與內皮細胞損傷以及巨噬細胞泡沫化過程，是動脈粥樣硬化斑塊形成進展中的重要機制[10]。為了檢測小鼠體內的氧化應激水平，我們利用DCFH-DA探針來標記ROS。結果顯示，ApoE-/-+HFD組的ROS水平可見明顯升高，而ApoE-/-+HFD+Vaccarin組中，ROS水平則明顯下降(Fig 4 A, B)。免疫印跡結果顯示，ApoE-/-+HFD組中，p38 MAPK磷酸化水平明顯上升，而vaccarin則可逆轉p38 MAPK的磷酸化表達(Fig 4 C, D)。上述結果表明，vaccarin抑制了動脈粥樣硬化小鼠ROS/p38 MAPK信號通路的活化。

4 討論

動脈粥樣硬化是一種發病機制復雜的慢性血管炎性疾病，血管內皮損傷及功能障礙在其發生發展過程中，發揮著重要作用[11]。血管內皮損傷可由多種刺激引起，如內皮細胞纖維化、內皮細胞炎癥及凋亡等[12]。作為一個中藥活性單體，vaccarin可降低高血壓大鼠的血壓、改善心血管重構、抑制高糖刺激的血管內皮功能障礙[7]，這揭示vaccarin在心血管系統中的重要作用。本文主要探討的是vaccarin對于動脈粥樣硬化的影響及其分子機制。動脈粥樣硬化受累動脈病變始于內膜，表現為內膜炎癥、纖維化以及脂質沉積。動脈粥樣硬化斑塊纖維化的形成主要由于脂質積聚，黏附因子增加導致平滑肌遷移至脂質沉積部位后發生壞死，引起細胞外基質過度沉積，形成纖維帽，最終可進一步導致動脈血管硬化[13]。我們的結果顯示，與ApoE-/-+HFD組小鼠相比，ApoE-/-+HFD+Vaccarin組小鼠動脈粥樣硬化斑塊的纖維化水平降低，表明vaccarin可以改善動脈硬化斑塊纖維化病變。動脈粥樣硬化的發生發展與血管內皮炎癥及凋亡密切相關[14]。在本次實驗中，我們發現與ApoE-/-+HFD組小鼠相比，ApoE-/-+HFD+Vaccarin組小鼠IL-6、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的表達明顯降低，同樣vaccarin抑制了NFκB p65蛋白的核轉移；以及改善了抑凋亡蛋白Bcl-2的下調和促凋亡蛋白Bax, c-caspase-3的上調。以上結果說明，vaccarin或許可以通過改善血管內皮炎癥以及凋亡來達到改善動脈粥樣硬化病變的效果。活性氧(ROS)在細胞凋亡以及炎癥反應過程中發揮著重要作用[15]，與動脈粥樣硬化疾病的發病機制密切相關[16]。另外，ROS在多種病理生理信號轉導中發揮重要作用，如p38 MAPK、NFκB p65的激活[18]。p38 MAPK也被證明作為內皮細胞炎癥及凋亡的關鍵靶點參與動脈粥樣硬化過程[17]。我們此次的實驗結果顯示，vaccarin可抑制ApoE-/-+HFD組小鼠主動脈ROS的產生以及p38 MAPK蛋白的磷酸化程度。這進一步說明vaccarin通過抑制ROS/p38 MAPK信號通路活化改善動脈粥樣硬化。我們的研究成果表明，vaccarin或可作為治療與動脈血管內皮損傷相關的心血管疾病的潛在藥物。