神經酸對帕金森病小鼠運動障礙的改善及保護作用

胡丹東，崔玉娟，張 繼

(1.北京市延慶區食品藥品安全監控中心，北京 102100；2.西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730070；3.北京市延慶區疾病預防控制中心，北京 102100)

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種常見的神經退行性疾病，全世界約有3%的60歲以上老人患有PD，隨著人口老齡化人數的不斷增加，其發病率呈大幅增長趨勢。PD的典型癥狀，包括肌肉僵硬、運動遲緩、震顫和姿勢不穩等運動障礙，還有感覺、情緒、認知和自主神經缺陷等多種非運動性癥狀[1-2]。大量研究表明，PD的基本病理特征是紋狀體和黑質致密部多巴胺神經元的丟失、減少和路易小體在神經元內的積聚，這些因素綜合作用可能是導致運動障礙癥狀的原因。多巴胺(DA)、酪氨酸羥化酶(TH)、多巴胺轉運蛋白(DAT)和α-突觸核蛋白(α-synuclein)等分子被作為PD的標志物大量研究。目前，在攜帶α-synuclein基因特異性點突變的PD患者中，5-羥色胺(5-HT)的濃度水平被認為是PD的一個新標志物[3]。

神經酸(nervonic acid，NA)最初發現于哺乳動物的腦部神經組織中，因此命名為神經酸。NA是神經細胞維持生命活動不可缺少的核心成分，是修復受損神經的特效物質，據報道NA與大腦發育有關，可以減輕各種神經系統疾病[4]；NA缺乏可能會促進前驅癥狀患者向精神病的轉化[5]；血漿神經酸水平升高是重性抑郁障礙、雙相情感障礙和精神分裂癥患者的一種常見趨勢[6]；神經酸鞘脂和神經酸合成酶的年齡依賴性積聚，表明這些因素對正常和病理性腦老化有潛在影響[7]。因此，NA可能具有較好的神經保護作用。

目前，NA通過保護神經元改善PD運動障礙的報到較少，特別是對NA保護作用機制的系統研究更是少有報道。本研究通過構建PD小鼠模型，確定了NA對MPTP誘導的小鼠PD是否具有神經保護作用，揭示NA可通過提高紋狀體DA、5-HT和TH、DAT的水平，抑制炎性因子表達，降低α-synuclein的表達和氧化應激來減輕運動障礙，從而為PD治療提供新的候選藥物。

1 材料

1.1 主要試劑和儀器神經酸(NA)(恒科生物科技股份有限公司，批號：ZC-21199-500 mg，含量90%，上海)；MPTP(Sigma，批號：M0896-100 mg，美國)；ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：E-EL-M0038c，武漢)；RNA提取試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號：R0039-1 mg，上海)；BCA蛋白試劑盒(Sigma，批號：BCA1-1KT，美國)；ECL試劑盒(Thermo，批號：32132-100 mL，美國)；抗體(Abcam，英國)；SOD、GSH、MDA試劑盒(南京市建城生物工程研究所，SOD批號：a006-2-1 96T、GSH批號：a006-1-1 96T、MAD批號：a003-3-1 96T，南京)。

高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，Agilent 1200s，美國)；電化學分析池(賽默飛世爾科技有限公司，CoulArray 5600A，美國)；酶標儀(美國熱電公司，MK3，美國)；實時熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司，ABI 7500，美國)。

1.2 實驗動物分組雄性C57BL/6小鼠(8-10周齡，20-22 g)購自北京實驗動物研究中心，飼養在標準動物房內，可自由獲得食物和水。動物實驗完全按照美國國立衛生研究院的指導方針進行，所有動物的治療和行為測試均在光周期中進行。為確定NA的作用，將40只小鼠隨機分為5組(n=8)，包括對照組、模型組、低劑量組(20 mg·kg-1-NA)、中劑量組(40 mg·kg-1-NA)和高劑量組(60 mg·kg-1-NA)，除對照組外，其余各組小鼠均給予MPTP(20 mg·kg-1溶于PBS中，腹腔注射)3 d誘導實驗性PD模型。然后灌胃處理不同濃度的NA，對照組和模型組給予等量生理鹽水，14 d后進行進一步的研究[8]。

2 方法

2.1 行為學測試

2.1.1爬桿試驗 該實驗評價NA對小鼠運動協調的影響。實驗前至少1 h，讓小鼠適應環境。籠子內固定一根直徑9 mm、長度1 m的木桿，小鼠被放在木桿的頂端，記錄下降到地面的時間[9-10]。

2.1.2滾輪實驗 該實驗評價NA對小鼠運動平衡的影響。實驗前至少1 h，讓小鼠適應環境，然后將小鼠放在加速桿上(4-40 r·min-1，最多5 min)，記錄第一次跌倒的時間[9-10]。

2.1.3曠場試驗 該實驗評價NA對小鼠自主、探究行為能力的影響。實驗前至少1 h，讓小鼠適應環境。在每次實驗中，將動物輕輕地放在方形木箱(60 cm×60 cm)的中心區域。使用Digiscan監視器(Omnitech Electronics)記錄運動和行為，每隔10 min記錄一次數據。在下一次試驗之前，用乙醇溶液擦拭木箱并干燥[11]。

2.2 高效液相色譜分析收集紋狀體的勻漿，在4 ℃下3 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，使用HPLC和電化學檢測分析紋狀體多巴胺(DA)、5-HT和相關代謝物3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)和5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)的濃度。對于DA和5-HT的檢測，使用流動相為[75 mmol·L-1乙酸鈉、15 μmol·L-1EDTA(pH 6.0)、16%甲醇、3 mmol·L-1十二烷基硫酸鈉和16%乙腈]；對于代謝物的檢測，使用流動相為[100 mmol·L-1KH2PO4、10 mmol·L-1庚烷磺酸鈉、150 μmol·L-1EDTA(pH 3.9)、5%甲醇和5%乙腈]；用C18反相柱(Agilent Technologies)，流動相流速為0.5 mL·min-1，柱溫37 ℃，通過電化學分析池進行定量，所有數據均使用CoulArray 3.10版軟件進行分析。

2.3 ELISA檢測收集紋狀體的勻漿，在4 ℃下3 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，分析炎性細胞因子釋放情況。用ELISA法檢測血清樣本中的IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白水平。

2.4 qRT-PCR用TRIzol法從紋狀體組織中提取總RNA，用TaqMan一步法將RNA反轉錄成cDNA。通過實時熒光定量PCR儀進行qRT-PCR實驗。用2-ΔΔCt法計算IL-1β、IL-6、TNF-α的相對mRNA表達水平，以GAPDH為內標，特異性引物序列如下：IL-1β正向引物5′-TAACCTGCTGGTGTGTGACGTTCC-3′，IL-1β反向引物5′-TCTTCTTCTTTGGGTATTGCTTGG-3′；IL-6正向引物5′-GAGACTTCCATCCAGTTGCCTTC-3′, IL-6反向引物5′-GATTGTTTTCTGCAAGTGCATCA-3′；TNF-α正向引物5′-TGAGCACAGAAAGCATGATC-3′，TNF-α反向引物5′-CATCTGCTGGTACCACCAGTT-3′；IL-10正向引物5′-AGTGGAGCAGGTGAAGAATG-3′，IL-10反向引物5′-CCAGCCTTAGGATCGAAGTT-3′；GAPDH正向引物5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCTG-3′，GAPDH正向引物5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTTC-3′。

反應體系為：2×SYBR?Green Realtime PCR預混液12.5 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA模版2 μL，加ddH2O至25 μL。循環為：95 ℃變性5 min；95 ℃持續15 s、55 ℃持續15 s、72 ℃持續10 s，進行40個循環；72 ℃延伸5 min。

2.5 Western blot分析分離小鼠紋狀體，然后用含有1% PMSF和1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解組織。通過BCA蛋白試劑盒檢測總蛋白的蛋白濃度。用10% SDS-PAGE將每個樣品中等量的蛋白質裝載并分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用5%脫脂乳溶液封閉1 h后，將膜與一級抗體在4 ℃下孵育過夜。隨后洗滌膜并與二級抗體(抗小鼠IgG或抗兔IgG，1 ∶10 000)在室溫下孵育2 h。最后，使用ECL試劑盒對膜進行成像，并使用ImageJ軟件進行定量。

2.6 SOD、GSH和MDA的定量分析將小鼠麻醉，取出大腦，用PBS清洗幾次，立即分離紋狀體，并用50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.4(1/10，W/V)均質。然后將勻漿10 000 r·min-1離心10 min，用試劑盒檢測SOD、GSH和MDA活性水平。

3 結果

3.1 神經酸對PD小鼠行為缺陷的改善采用爬桿試驗、滾輪試驗和曠場試驗對小鼠運動行為進行監測，以檢測NA對小鼠運動功能的影響。在爬桿實驗中，PD小鼠爬桿時間明顯延長，模型組為(33.6±2.59)s，對照組為(6.85±1.32)s(P<0.01)，而經過NA處理組小鼠爬行時間明顯縮短，且呈劑量依賴性(P<0.01)。通過滾輪實驗評價了NA對PD小鼠運動平衡行為缺陷的影響，與對照組相比，MPTP誘發PD模型的平均滾動時間縮短了57%，相反在NA處理后各組都延長了滾輪時間(P<0.05)。在曠場實驗評價自主、探究行為能力的影響方面，PD小鼠自主活動次數明顯減少，模型組為(69.23±6.43)r·min-1，對照組為(98.36±10.83)r·min-1，與此相反NA給藥后顯示出神經保護作用，小鼠表現出比模型組更多的自發運動，自發運動次數由(77.68±7.63)r·min-1增加到(89.38±9.34)r·min-1，但僅中、高劑量NA組與模型組比較差異有顯著性(P<0.05)，低劑量NA組與模型組比較差異并不明顯。

3.2 神經酸對紋狀體DA、5-HT及其代謝物水平的影響為了研究NA是否能防止多巴胺系統的退化，用HPLC法測定了紋狀體中多巴胺(DA)及其相關代謝產物二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)，5-羥色胺(5-HT)及其相關代謝物5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)的濃度。如Fig 1A所示，MPTP處理后顯著降低了紋狀體DA和相關代謝物DOPAC、HVA的濃度水平，DA水平較對照組降低5倍(P<0.05)，與模型組相比，中劑量(40 mg·kg-1)和高劑量(60 mg·kg-1)NA處理使DA及相關代謝物的平均濃度明顯升高。如Fig 1B所示，紋狀體5-HT和相關代謝物5-HIAA的趨勢一致，模型組5-HT和5-HIAA水平較對照組分別降低70.2%和71.4%，通過NA處理，5-HT和5-HIAA的水平以劑量依賴性的方式恢復。結果表明，NA能阻止PD模型中DA和5-HT的丟失。

Fig 1 Effect of NA on concentration of DA, 5-HT and its metabolites in

3.3 神經酸對紋狀體TH、DAT蛋白表達的影響為揭示NA對紋狀體中的TH的影響，通過Western blot分析監測TH表達變化水平。如Fig 2所示，在MPTP誘導的小鼠模型中觀察到TH顯著減少，但是通過中劑量和高劑量NA處理明顯提高了TH蛋白的表達水平(P<0.01)，而低劑量NA處理則使TH蛋白表達輕度上調(P<0.05)。為了確定NA是否對DAT蛋白的表達水平有影響，同時檢測了紋狀體中DAT蛋白的表達的變化，如Fig 2B所示，DAT與TH蛋白表達變化趨勢相同。結果表明，NA對多巴胺系統有保護作用，這與行為學運動障礙的改善及DA、5-HT代謝水平變化的結果一致。

Tab 1 Effect of NA on motor function of PD

Fig 2 Effect of NA on expression of TH and DAT protein in

3.4 神經酸對紋狀體內炎癥反應的影響如Fig 3A所示，與對照組相比，MTPT誘導的PD小鼠的紋狀體中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的表達有明顯上升；與模型組相比，經NA處理后各濃度組均能抑制炎性因子的表達水平，并且呈劑量依賴性(P<0.05)，但是低劑量差異并不明顯。進一步通過qRT-PCR測定炎性因子的mRNA表達水平，與ELISA檢測結果相似，與模型組相比降低了炎癥因子的表達水平(P<0.05)。

Fig 3 Effect of NA on inflammation of

3.5 神經酸對α-突觸核蛋白的表達及氧化應激反應的影響如Fig 4A所示，MPTP處理明顯上調紋狀體中α-突觸核蛋白的表達，而NA以劑量依賴性方式降低α-突觸核蛋白的表達(P<0.05)。考慮到氧化應激的增加可引起α-突觸核蛋白的聚集，檢測了小鼠紋狀體中抗氧化標記物SOD和GSH的活性水平，以及MDA的含量變化。如Fig 4B所示，與對照組相比，MPTP組小鼠紋狀體SOD和GSH活性降低，模型組SOD和GSH活性分別下降約70%和65%；而NA能明顯提高SOD活性，同樣NA處理也明顯提高了PD小鼠模型中GSH的水平。如Fig 4C所示，與對照組相比，MDA的含量增加3倍，經過NA處理后，各組均明顯降低了MDA的含量。

Fig 4 Effect of NA on expression of α-synuclein protein and oxidation stress

4 討論

MPTP作為一種神經毒性污染物，被廣泛應用于嚙齒類動物的PD病理誘導，這種神經毒素可以通過血腦屏障，進一步轉化為毒性形式-1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)，并轉移到多巴胺神經元，導致多巴胺神經元的丟失或抑制線粒體功能[12]。大量研究表明，MPTP給藥后動物都有多巴胺系統退化、氧化應激反應、線粒體功能障礙和炎癥反應等PD癥狀產生[13]。因此，本研究構建了由MPTP誘導的PD小鼠模型，在研究過程中，與對照組相比，MPTP處理后，爬升時間顯著增加，而平均滾動時間顯著減少，同樣實驗組小鼠在開放區域的自發活動也較少，與PD具有很高的相似性；同時，在模型中除了紋狀體DA、TH、DAT的下調外，α-突觸核蛋白的高水平和氧化應激的激活也得出了相同的結果趨勢；此外，模型中的炎癥因子水平也有顯著升高。綜上所述，本研究成功地建立了PD小鼠運動障礙模型。

近年來，許多基于食物或植物的天然產物作為藥物治療的補充策略被用于治療PD[14]，蟲草素通過抑制MAPK信號通路的激活對PD小鼠神經元起保護作用[15]，醉茄素類化合物也被用于神經系統疾病的治療[16]。NA在一些植物的果實和種子油中含量較高，其功效也引起了國內外相關學者的關注。大量對神經酸的研究發現，NA具有能夠促進腦部發育、提高腦神經活躍程度、提高記憶力、防止腦神經衰老等作用。本研究著重研究了NA對帕金森的保護作用機制。首先，NA對MPTP誘導的運動障礙有部分保護作用，并在PD模型中表現出神經保護作用；其次，鑒于DA、5-HT、TH、DAT和α-突觸核蛋白是PD的標志物，進一步研究了NA對這些分子的影響，在MPTP誘導后給予NA處理可避免紋狀體DA、5-HT及其代謝物含量的降低，促進多巴胺神經元活性標記酶TH、DAT的蛋白表達，抑制紋狀體α-突觸核蛋白的表達；此外，NA的處理抑制了紋狀體中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的表達。研究也進一步證實了NA參與氧化應激反應與α-突觸核蛋白的丟失有關，通過上調PD小鼠模型SOD和GSH活性、降低MDA濃度，揭示了NA可能具有抗氧化作用。本研究結果表明，NA作為植物提取物是治療PD的安全藥物，為PD的治療提供了新思路。

綜上所述，NA通過調節多巴胺系統、提高標志蛋白表達、抑制炎癥因子表達和抑制氧化應激，對PD神經元起保護作用，從而改善PD小鼠的運動障礙。