甘木通活性化合物的抗氧化活性及對H2O2誘導的H9C2心肌細胞損傷的保護作用

梁 璐，蔡曉彤，岑慧裕，徐文艷，洪 超，譚 霖，余細勇

(廣州醫科大學藥學院，第五附屬醫院分子靶點與臨床藥理學重點實驗室，呼吸道疾病國家重點實驗室，廣東 廣州 511436)

心血管疾病目前死亡率是排名第一，嚴重威脅著人類健康[1-2]。心血管疾病發生機制非常復雜，心肌細胞損傷是各種心血管疾病的病理生理學基礎[3]。心肌細胞的凋亡可能由氧化應激導致，進一步損傷心肌細胞的正常生理功能，最終導致心力衰竭等心血管疾病的發生[3]。抗氧化劑發揮抗氧化作用包括直接途徑和間接途徑，前者是通過抗氧化劑提供氫或電子，對自由基、活性氧和活性氮等起到直接抑制作用；而間接途徑涉及通過誘導II期解毒和抗氧化酶的高表達來提供對氧化應激的防御[4]。因此，臨床上應更加關注氧化應激在心臟損傷中的發病機制，開發更多抗氧化劑的治療干預手段。

由于天然抗氧化劑的高安全性，植物抗氧化劑的研究引起了人們的廣泛關注[5]。本研究所選植物甘木通含有珍貴的木脂素和黃酮類化合物，具有多種藥理作用。甘木通(ClematisfilamentosaDunn.)是毛莨科絲鐵線蓮屬植物，在我國廣東、廣西、海南、云南等地均有分布，其對多種心血管疾病有較好的治療效果。然而，甘木通中藥理活性成分尚不清楚，目前缺乏從甘木通中分離提取的單體化合物對心血管系統疾病的研究。本研究通過分離純化甘木通提取物，得到木犀草素、咖啡酸、落葉松樹脂醇、脲醛苷、二氫脫氫雙煙酰基醇、芹菜素、黃芩苷、蒙花苷、齊墩果酸和鼠尾草素，化學結構如Fig 1所示。H2O2是一種性質穩定的細胞損傷模型的誘導劑，易于穿透細胞膜進入胞內，H2O2誘導心肌細胞氧化損傷是目前實驗室常用的一種心肌細胞損傷造模方法[6]，能較好地模擬體內細胞損傷過程[7]。本研究以大鼠H9C2細胞為研究對象，探討甘木通中10種化合物的抗氧化活性及其對H2O2誘導的H9C2心肌細胞損傷的保護作用，旨在為甘木通活性化合物的臨床應用及心肌細胞損傷的藥理作用研究提供參考依據。

Fig 1 The chemical structures of isolated compounds from Clematis filamentosa Dunn.

1 材料與方法

1.1 植物材料甘木通采集于中國省云南永壽區，由云南大學中國傳統醫學李國棟教授鑒定。

1.2 實驗儀器低溫高速離心機(德國Hettich 公司)；垂直電泳槽、轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；凈工作臺(蘇州儀器廠)；CO2培養箱(Thermo)；-80 ℃冰箱(Thermo Fisher Scientific Inc)；酶標儀(美國加利福尼亞州森尼維爾市分子設備公司)；Agilent StrataGene Mx3000P QPCR(Agilent Technolo-gies)；流式細胞儀(Becton Dickinson-Facsort)。

1.3 實驗試劑DMEM培養基(貨號：12491-015)、胎牛血清(貨號：10099)購于美國Gibco公司；胰蛋白酶(貨號：T2601)、青-鏈霉素溶液(貨號：ZS507)、MTT(貨號：M2128)、DMSO(貨號：D2650)購自美國 Sigma 公司；GAPDH 抗體(貨號：TA-08)、抗兔二抗(貨號：ZDR-5118)、抗鼠二抗(貨號：ZDR-5117)購自北京中杉金橋；anti-caspase-3抗體(貨號：AB13847)、anti-HO-1 抗體(貨號：AB13248)、anti-β-actin抗體(貨號：AB8227)購自Abcam公司；Lipofectamine 2000(貨號：11668027)、TRIzol(貨號：10296010)購自美國Invitrogen公司；熒光素酶報告試劑盒(貨號：KA3714)購自美國Promege 公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：C1067S)購自碧云天生物公司，Quantitect逆轉錄試劑盒(貨號：204145)購自德國Qiagen公司。

1.4 細胞培養從上海生物科學研究所(中國上海)購買H9C2心肌細胞，細胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的細胞培養基中培養，并置于37 ℃、5% CO2的培養箱中。

1.5 細胞活性測定96孔板中每孔接種3 000個H9C2細胞。24 h后，將細胞分別與從甘木通中分離的10個化合物(最終濃度分別為5、10和20 μmol·L-1)進行預培養12 h，然后用450 μmol·L-1的H2O2處理，1 h后，用新的培養基替換原培養基，24 h后往各孔加入20 μL MTT試劑，混勻，于37 ℃孵育4 h。棄上清后各孔加入150 μL二甲基亞砜，于37 ℃孵育30 min，用酶標儀檢測各孔在570 nm處的吸光度(OD值)。

1.6 DPPH自由基清除活性測試將10 μL樣品(終濃度分別為5、10、20 mol·L-1)與90 μL的乙醇充分混合均勻后加入200 μL 0.004% DPPH。將其混勻，然后立即放入紫外可見分光光度計，以監測517 nm處的吸光度下降過程，持續監測70 min，直到反應達到穩定狀態。抗壞血酸是一種穩定的抗氧化劑，作為合成參考物，純乙醇作為對照樣品。IC50值表示清除DPPH抑制產生的50%自由基所需的濃度/%=[(空白樣品吸光度值AB-被測樣品吸光度值AA)/空白樣品吸光度值AB]×100%。

1.7 還原能力測定用鐵還原法評價從甘木通中分離得到的化合物的鐵還原活性。取甘木通提取物乙醇溶液500 μL，分別加入等量0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀，50 ℃孵育20 min，加入10%三氯乙酸2.5 mL，650 r·min-1離心10 min。取500 μL上層溶液與500 μL蒸餾水和100 μL 0.1% FeCl3混合，檢測700 nm處的吸光值。

1.8 流式細胞術將H9C2心肌細胞與20 μmol·L-1木犀草素、20 μmol·L-1二氫脫氫雙煙酰基醇、5 μmol·L-1落葉松樹脂醇、20 μmol·L-1芹菜素、20 μmol·L-1脲醛苷、5 μmol·L-1咖啡酸培養12 h，然后暴露于450 μmol·L-1H2O2中1 h，用PBS洗滌兩次并收集細胞，加入5 μL Annexin V-FITC，4 ℃避光孵育10 min，用PI復染，10 min后測定各組凋亡率。

1.9 活性氧測量利用DCFH-DA流式細胞儀監測活性氧的生成。將H9C2心肌細胞與20 μmol·L-1木犀草素、20 μmol·L-1二氫脫氫雙煙酰基醇、5 μmol·L-1落葉松樹脂醇、20 μmol·L-1芹菜素、20 μmol·L-1脲醛苷、5 μmol·L-1咖啡酸培養12 h，隨后暴露于450 μmol·L-1H2O2中1 h，然后，將細胞加入含50 mmol·L-1葡萄糖的PBS中，在37 ℃環境下與10 μmol·L-1DCFH-DA孵育30 min，流式細胞儀測定非特異性細胞酯酶水解二氯二氫熒光素-二醋酸酯(DCFH-DA)與DCFH的熒光生成以及隨后的過氧化物氧化DCFH的結果。

1.10 Western blot提取總蛋白后進行蛋白定量。在12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠的電泳孔中分別加入marker和蛋白樣品后在100 V恒壓下電泳，250 mA恒流轉膜，室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST將硝酸纖維素膜封閉1 h。然后孵育一抗：anti-caspase3(1 ∶1 000)、anti-HO-1(1 ∶500)，anti-GCLC(1 ∶500)和anti-β-actin(1 ∶10 000)。室溫孵育二抗1 h，用HRP化學發光液顯色。

2 結果

2.1 甘木通提取物的自由基清除作用和還原能力測定為了探究甘木通提取物對自由基清除活性是否有直接的抗氧化作用，采用DPPH法進行測定，結果顯示，自由基清除率與木犀草素、二氫脫氫雙煙酰基醇 、落葉松樹脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸劑量呈正相關，其中木犀草素具有最高的清除活性(Fig 2A)。并且，我們測定了10種甘木通提取物對Fe3+轉化為Fe2+的還原能力。鐵還原法測定結果顯示，還原力與木犀草素、二氫脫氫雙煙酰基醇、落葉松樹脂醇、芹菜素、黃芩苷、脲醛苷、咖啡酸和鼠尾草素濃度呈正相關，其中木犀草素還原力最高(Fig 2B)。

Fig 2 DPPH radical scavenging activities (A) and ferric reducing assays (B) of ten compounds from Clematis filamentosa Dunn.

2.2 甘木通提取物對H2O2誘導的H9C2心肌細胞損傷的影響MTT法測定結果表明，與對照組相比，20 μmol·L-1木犀草素、20 μmol·L-1二氫脫氫雙煙酰基醇、5 μmol·L-1落葉松樹脂醇、20 μmol·L-1芹菜素、20 μmol·L-1脲醛苷和5 μmol·L-1咖啡酸處理組細胞存活率從(49.46±2.32)%(H2O2單獨處理)顯著增加到(96.1±5.49)%，(80.65±6.37)%、(73.75±5.35)%、(77.23±0.9)%、(69.89±1.83)%和(62.42±2)%(Fig 3)。這些結果表明，從甘木通中分離得到的化合物減弱了H2O2誘導的H9C2心肌細胞損傷。因此，基于以上研究結果，我們用20 μmol·L-1木犀草素、20 μmol·L-1二氫脫氫雙煙酰基醇、5 μmol·L-1落葉松樹脂醇、20 μmol·L-1芹菜素、20 μmol·L-1脲醛苷和5 μmol·L-1咖啡酸進行進一步的研究。

Fig 3 Effects of ten compounds from Clematis filamentosa Dunn. on cell viability with or without 450 μmol·L-1 H2O2 in H9C2 cells

2.3 甘木通化合物對H2O2誘導的H9C2細胞內ROS水平的影響細胞內活性氧是細胞內的氧化應激指標[8]。DCFH-DA熒光探針研究結果顯示，木犀草素、二氫脫氫雙煙酰基醇、落葉松樹脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸對H2O2誘導的活性氧升高有抑制作用。單純H2O2處理的細胞平均熒光強度為(53.17±1.26)%。在H2O2誘導的H9C2心肌細胞中，木犀草素、二氫脫氫雙煙酰基醇、落葉松樹脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸處理后，其均值分別降為(9.48±2.05)%、(38.53±3.01)%、(12.62±2.13)%、(42.92±3.95)%、(10.5±1.39)%和(11.46±0.97)%(Fig 4A)。表明了甘木通提取物可以降低H2O2誘導的H9C2細胞內ROS的水平。

Fig 4 Effects of luteolin, dihydrodehydrodiconiferyl alcohol, lariciresinol, apigenin, urolignoside and caffeic acid from Clematis filamentosa Dunn. on ROS formation and apoptosis in H2O2-induced H9C2 cells

2.4 甘木通提取物對H2O2誘導的H9C2心肌細胞凋亡的影響流式細胞術檢測結果表明，H2O2誘導的H9C2心肌細胞凋亡率為(41.36±2.63)%，對照組為(2.73±1.34)%。在H2O2誘導的H9C2心肌細胞中，木犀草素、二氫脫氫雙煙酰基醇、落葉松樹脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸處理后，凋亡細胞的百分比分別下降到(10.5±2.69)%、(39.21±3.14)%、(12.31±1.58)%、(36.21±1.42)%、(13.21±2.09)%和(16.24±3.04)%(Fig 4B)。提示，甘木通提取物能顯著抑制H2O2誘導的H9C2心肌細胞凋亡。

2.5 甘木通提取物對H2O2誘導的H9C2心肌細胞中caspase-3和抗氧化酶表達的影響Western blot檢測結果顯示，450 μmol·L-1H2O2誘導后，cleaved-caspase-3的表達水平明顯提升。木犀草素、落葉松樹脂醇、脲醛苷、二氫脫氫雙煙酰基醇、芹菜素和咖啡酸能使H2O2誘導的H9C2心肌細胞中caspase-3的活化受到抑制。木犀草素、二氫脫氫雙煙酰基醇、落葉松樹脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸處理H2O2誘導的H9C2心肌細胞中HO-1和GCLC蛋白水平顯著升高(Fig 5)。我們的研究表明，通過抗氧化酶的激活，甘木通提取物可保護H9C2心肌細胞免受氧化損傷。

Fig 5 Effects of luteolin, dihydrodehydrodiconiferyl alcohol, lariciresinol, apigenin, urolignoside and caffeic acid from Clematis filamentosa Dunn. on caspase-3 and antioxidant enzyme expression in H2O2-induced H9C2 cells

3 討論

甘木通能擴張血管并改善血循環，其成藥“冠心康片”有緩解冠心病病人心絞痛的功效，但其確切的有效成分尚不明確，提示甘木通中活性成分對心肌細胞損傷的藥理作用及機制值得進一步探討。本研究從甘木通中提取得到木犀草素、咖啡酸、落葉松樹脂醇、脲醛苷、二氫脫氫雙煙酰基醇、芹菜素、黃芩苷、蒙花苷、齊墩果酸和鼠尾草素10個化合物。因此，甘木通的抗氧化特性可能與這些活性物質的存在有關。DPPH反應和還原能力測定結果表明，木犀草素的自由基清除能力和還原能力最強，其次是咖啡酸、落葉松樹脂醇、脲醛苷、二氫脫氫雙煙酰基醇、芹菜素、黃芩苷、蒙花苷、齊墩果酸和鼠尾草素。它們使H2O2誘導的氧化應激受到抑制，H9C2心肌細胞的存活率有所提高。其中木犀草素、二氫脫氫雙煙酰基醇、落葉松樹脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸具有較強的細胞保護作用，并進一步測定了它們對H2O2誘導的H9C2心肌細胞損傷的保護機制。

有報道指出，H2O2可通過刺激細胞產生ROS自由基誘發凋亡，ROS自由基過多已經成為缺血性心臟病的主要特征[9]。研究發現，ROS過量生成會導致線粒體滲透性轉換孔(mPTP)進一步開放，從而使線粒體膜電位去極化，caspase-3通路被激活，誘導細胞凋亡[10]。大量的活性氧能誘導產生細胞自噬，從而造成細胞死亡[11-12]。本研究結果表明，從甘木通中分離得到化合物(木犀草素、二氫脫氫雙煙酰基醇、落葉松樹脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸)能夠保護H9C2心肌細胞免受H2O2的損傷，降低H2O2誘導產生的活性氧積累，同時，抑制caspase-3的激活可進一步抑制細胞凋亡。因此，從甘木通中分離的化合物對H2O2誘導的H9C2心肌細胞凋亡的抑制作用與caspase-3凋亡途徑有關。

核因子NF-E2相關因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是氧化應激反應的轉錄因子，可與抗氧化反應元件ARE產生作用，誘導下游調控的多種解毒酶和抗氧化酶表達，使血紅素氧合酶(heme oxygenase 1，HO-1)和谷胱甘肽(GSH)的表達水平提高[13]，清除自由基，細胞內氧化還原平衡得到維持，保護內源性細胞。甘木通提取物能夠上調HO-1和GSH生物合成的限速酶(glutamate-cysteine ligase catalyzes the subunit，GCLC)的表達，提供了有效的內源性抗氧化防御機制。

綜上，甘木通活性化合物能減少H2O2對H9C2細胞的損傷，提高細胞活性并抑制其凋亡，改善心肌細胞內氧化應激。這可能與H9C2心肌細胞中抗氧化酶的激活有關。這些結果為甘木通活性化合物的臨床應用及心肌細胞損傷的藥理作用提供了參考。