miR-5088-5p在同型半胱氨酸致肝細胞焦亡中的保護作用研究

董小艷,劉達越,徐靈博,顧鈴毓,姜怡鄧,楊安寧,焦 運,李桂忠

(寧夏醫科大學 1.基礎醫學院、2.國家衛生健康委員會代謝性心血管疾病研究重點實驗室、3.寧夏血管損傷與修復研究重點實驗室、4.臨床醫學院、5.總醫院感染科，寧夏回族自治區，寧夏 銀川 750004)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)來源于蛋氨酸，其主要在肝臟中代謝，蛋氨酸代謝失調引起血漿中同型半胱氨酸積聚形成高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)[1]。研究表明，在肝臟脂肪變性患者血液樣本中血漿Hcy水平明顯升高，說明HHcy是肝臟疾病的重要危險因素[2]。同時，有學者認為高遷移率族蛋白1通過組織蛋白酶V依賴途徑介導同型半胱氨酸誘導內皮細胞焦亡[3]。還有研究顯示，在非酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝硬化、肝癌等疾病中肝細胞焦亡水平明顯升高[4]，過多的細胞焦亡會導致細胞無菌性炎癥，加速肝損傷。可見細胞焦亡與肝臟疾病的進展密切相關，但在許多方面仍尚不清楚。miRNAs是一種18-24個核苷酸的非編碼RNA，可通過調控細胞焦亡參與肝臟代謝失調、肝損傷、肝纖維化和腫瘤等多種疾病的發生發展，這使miRNAs的調控成為診斷和治療肝病的一個切入點[5]。故本研究目的是探討miR-5088-5p在Hcy致肝細胞焦亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑CO2細胞培養箱(Thermo Fisher，美國Scientific公司)；BS110S型精密天平(Sar-toriu公司)；5415D型微量臺式離心機(Eppendorf公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；普通PCR儀與qRT-PCR儀(耶拿公司)；細胞全蛋白提取試劑盒(P0013F，上海貝博生物技術有限公司)；胎牛血清和RPMI 1640培養液(2021472，812006，Gibco公司)；逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(AJ90851A，AJE1566A，寶日醫生物技術(北京)有限公司)；總RNA提取試劑盒(U9223，北京天根生物科技有限公司)；CBS+/-和CBS+/+美國Jackson實驗室(Bar Harbor，ME)提供；脂質體LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；Hcy(STBJ0903，優級純，德國Sigma公司)、miR-5088-5p上下游引物(S0626，Q1229，廣州銳博生物科技有限公司)； NLRP3(#10151，美國Cell Signaling Technology公司)；Caspase 1(AF5418，中國Affinity公司)；IL-1β(AF5103，購自中國Affinity公司)；內參抗體β-actin(AC028，中國abclonal公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與分組 人源肝細胞株(HL-7702)購自上海名勁生物科技有限公司，在37 ℃、5% CO2環境中培養，次日用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基換液，當細胞密度增長到70%-80%時用0、100 μmol·L-1Hcy干預，分為Control組、Hcy(100 μmol·L-1)組[1]、100 μmol·L-1Hcy+miR-5088-5p NC組和100 μmol·L-1Hcy+miR-5088-5p mimic組，培養48 h后收集細胞用于后續實驗。

1.2.2動物分組及飼養 4周齡體質量約20 g的CBS小鼠購自美國Jackson實驗室，在寧夏醫科大學實驗動物中心飼養，隨機選取12只雄性基因正常小鼠(CBS+/+，n=6)和單基因敲除(CBS+/-，n=6)小鼠給予高蛋氨酸(2%高蛋氨酸)飲食，飼養在SPF級環境中，溫度(22-25) ℃，濕度55%-65%，給飼養房環境定期紫外消毒，小鼠喂養12周之后處理用于后續實驗。

1.2.3Western blot測定焦亡相關蛋白的表達 將各組肝細胞裂解提取總蛋白，采用BCA試劑盒進行定量后，加入蛋白上樣緩沖液95 ℃煮沸5 min變性，經SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉，4 ℃孵育兔抗鼠NLRP3抗體(1 ∶500)、兔抗鼠caspase 1抗體(1 ∶500)、兔抗鼠 IL-1β抗體(1 ∶500)過夜；PBST洗膜3次，每次8 min，加HRP標記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)，室溫孵育2 h時；PBST洗膜3次，每次8 min，配制ECL試劑化學發光液，顯影，β-actin作為內參，計算NLRP3、Caspase 1與IL-1β灰度值用來分析。

1.2.4qRT- PCR檢測肝細胞中miR-5088-5p的表達 委托銳博生物科技有限公司設計合成miR-5088-5p的引物。根據RNA提取試劑盒提取肝細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，逆轉錄反應條件為：42 ℃ 15 min，37 ℃ 5 s，4 ℃保存。熒光定量PCR擴增程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5s，60 ℃ 34s，45個循環，反應結束后，根據擴增曲線數據，按照公式2-△△Ct計算miR-5088-5p的含量，ΔΔCt=(Ct待測樣本目的基因-Ct待測樣本內參基因)-( Ct校正樣本目的基因-Ct校正樣本內參基因)。

1.2.5轉染miR-5088-5p至肝細胞 轉染方法：培養肝細胞至對數生長期，待細胞融合達到80%，在1.5 mL EP管中加入10 μL mimic/10 μL NC融到490 μL純RPMI 1640培養基中，混勻，10 μL Lipofectamine 2000融到490 μL純RPMI 1640培養基中輕輕吹勻，靜止5 min，再將混合轉染試劑和mimic稀釋液混合輕輕吹吸5次，室溫下靜止20 min，將上述轉染混合物加入培養瓶再加純RPMI 1640培養基補齊至4 mL，放入培養箱繼續培養，6 h后換液用Hcy刺激48 h，嚴格根據說明書將miR-5088-5p模擬物和miR-5088-5p陰性對照轉染到HL-7702細胞用于后續實驗。

1.2.6鑒定小鼠基因型 取小鼠腳趾，根據基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。選用巢式降落式特異性PCR反應擴增DNA，擴增程序如下：95 ℃ 2 min 1×;95 ℃ 20 s 65 ℃ 15 s 68 ℃ 10 s, 10×;95 ℃ 15 s 60 ℃ 15 s 72 ℃ 10 s, 28×;72 ℃ 2 min, 1×;10 ℃保存，反應結束后，配制2%瓊脂糖凝膠，140 V電泳20 min，顯影儀曝光，保存結果。

1.2.7檢測小鼠血清同型半胱氨酸水平 將小鼠麻醉后，稱體質量，固定，眼球取血并5 000 r·min-1離心，收集上清，采用全自動生化儀檢測其血清中同型半胱氨酸的水平。

1.2.8采用免疫熒光染色檢測肝組織焦亡相關蛋白表達 將石蠟切片在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各脫蠟20 min，100%、95%、85%、75%、50%梯度酒精水化，抗原修復，自然冷卻至20 ℃，3%過氧化氫封閉之后，0.3% Triton X-100 室溫通透8 min，5%山羊血清封閉2 h，4 ℃環境下孵育一抗NLRP3(1 ∶50)、caspase 1(1 ∶150)和IL-1β(1 ∶200)過夜，PBS溶液清洗切片3次，每次6 min，滴加Cy3標記的熒光二抗室溫下孵育2.5 h，洗片后滴加DAPI，封片熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2 結果

2.1 肝細胞中NLRP3、Caspase 1和IL-1β 蛋白表達情況為了探討Hcy對肝細胞焦亡的影響，通過Western blot檢測焦亡相關蛋白，與Control組相比，Hcy組NLRP3、caspase 1和IL-1β蛋白表達水平明顯升高(均P<0.01)，表明Hcy能夠促進肝細胞焦亡，見Fig 1。

Fig 1 Expression of NLRP3, Caspase-1 and IL-1β in hepatocytes detected by Western n=3)

2.2 肝細胞中miR-5088-5p表達水平為了驗證miR-5088-5p在Hcy致肝細胞焦亡過程中的變化，采用qRT-PCR檢測肝細胞中miR-5088-5p表達水平，結果顯示：與Control組相比，Hcy組miR-5088-5p的表達水平降低(P<0.01)，提示miR-5088-5p可能參與Hcy誘導的肝細胞焦亡，見Fig 2。

Fig 2 mRNA expression of miR-5088-5p in hepatocytes detected by

2.3 過表達miR-5088-5p后肝細胞焦亡相關蛋白表達情況為進一步研究miR-5088-5p在肝細胞焦亡中的作用，將miR-5088-5p mimic轉染至肝細胞，分為Control組，Hcy組，Hcy+NC組，Hcy+mimic組，采用Western blot檢測NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白的表達，結果顯示：與Hcy組相比，Hcy+NC組NLRP3、caspase 1和IL-1β蛋白的表達無差異；與Hcy+NC組相比，Hcy+mimic組NLRP3、Caspase 1和IL-1β蛋白的表達明顯下降(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，表明miR-5088-5p過表達可以減少由Hcy引起的肝細胞焦亡的增加，見Fig 3。

Fig 3 Expression of NLRP3, caspase 1 and IL-1β Protein in hepatocytes after transfection of miR-5088-5p

2.4 鑒定CBS小鼠基因型及檢測小鼠血清Hcy水平為了驗證小鼠為基因敲除小鼠，進行CBS小鼠基因型鑒定，結果見Fig 4A，針對小鼠基因型設計特異性引物，采用普通PCR對基因敲除小鼠進行鑒定，其中，單條帶為CBS+/+小鼠，雙條帶為CBS+/-小鼠。同時采用全自動生化儀對小鼠血清同型半胱氨酸水平進行檢測，結果顯示，與CBS+/+組小鼠比較，CBS+/-組小鼠血清中Hcy濃度升高(P<0.01)，表明CBS小鼠模型復制成功，見Fig 4B。

2.5 免疫熒光檢測肝組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達水平為了明確Hcy引起焦亡相關蛋白的表達增加，采用免疫熒光檢測肝組織中NLRP3、caspase 1、IL-1β蛋白表達(見Fig 5A、C、E)并對小鼠肝臟組織中NLRP3、caspase 1、IL-1β蛋白的陽性面積進行定量分析，其中紅色代表NLRP3、caspase 1、IL-1β表達含量，藍色代表細胞核。結果顯示：與CBS+/+小鼠相比，CBS+/-組小鼠肝組織中NLRP3、caspase 1、IL-1β蛋白的陽性面積比例增加(P<0.01)，表明Hcy能夠促進焦亡相關蛋白在肝臟中表達，見Fig 5B、D、F。

3 討論

Hcy是一種含硫氨基酸，是蛋氨酸代謝的中間產物。Hcy的代謝途徑受復雜的酶系統調控，胱硫醚β合成酶(cystathionine b-synthase，CBS)是反式硫化途徑中的第一個酶，CBS催化同型半胱氨酸轉化為半胱氨酸，當CBS的活性降低，Hcy不能夠充分的通過轉硫途徑轉換為胱硫醚，從而在體內蓄積引起肝臟損傷[6-7]，同時升高的Hcy可促進肝細胞凋亡、肝臟纖維化等多種肝臟病變[8-9]。肝臟損傷又進一步導致Hcy的積累進而惡性循環。可見，Hcy與肝臟疾病關系密切。本課題組前期研究發現Hcy可通過下調囊性纖維化跨膜電導調節因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)的表達，導致內質網應激和肝細胞凋亡，CFTR的表達下調在體內外可促進自噬，加重肝損傷[10-11]。為了更進一步探討Hcy對肝損傷的影響，本實驗建立CBS+/-小鼠高同型半胱氨酸血癥模型后，肝臟組織免疫熒光結果顯示，肝細胞焦亡水平明顯增加。說明Hcy可以誘導肝細胞焦亡的發生。

細胞焦亡(pyroptosis)是一種獨特的程序性細胞死亡形式，其特征是DNA斷裂、染色質濃縮、細胞腫脹且有大氣泡，以及細胞內容物泄漏[12]。在細胞焦亡經典途徑中，炎性小體起著重要作用。炎性小體是先天免疫系統的一個組成部分，而NLRP3是最常見的炎癥小體之一。這種炎癥小體誘導的細胞焦亡與炎癥性疾病有很強的聯系，在細胞、小鼠和人體樣本的實驗表明，一種特殊的細胞死亡形式—焦亡，會導致復雜的炎性顆粒NLRP3炎性小體從肝細胞內釋放到細胞外空間后被其他細胞吸收，從而介導炎癥和促纖維化的應激信號，這是新發現的一種肝損傷的新機制[13]。隨著我們對涉及細胞死亡的分子機制的不斷加深理解，我們對急性和慢性肝損傷如壞死、焦亡和自噬等各種細胞死亡模式有了更廣泛的認識[14]。我們的結果表明，Hcy刺激肝細胞后，細胞焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase 1和IL-1β蛋白表達顯著增加，說明Hcy可以通過NLRP3炎癥小體形成來促進細胞焦亡。

miRNAs是一種內源性非編碼RNA，在肝臟疾病中發揮關鍵作用[15]。有學者研究表明，miR-21缺失抑制了小鼠和人類骨髓細胞中NLRP3和caspase 1的表達，促進NLRP3炎性小體激活，介導焦亡過程[16]。miR-5088-5p屬于miRNAs，因此本實驗重點關注miR-5088-5p的作用，經Hcy刺激肝細胞后miR-5088-5p表達下調，當過表達miR-5088-5p后，肝細胞焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase 1、IL-1β表達下降，同時免疫熒光結果也證實了該現象，說明miR-5088-5p參與了Hcy引起的肝細胞焦亡，且對肝細胞焦亡有保護作用。目前，抑制焦亡的策略主要有兩種。一種是通過調控途徑抑制NLRP3炎癥體，例如，MCC950被稱為NLRP3抑制劑，可以有效減輕膽脂性肝損傷和膽管結扎小鼠模型的炎癥[17]。另一種策略是抑制NLRP3炎癥小體激活后的下游信號通路。本實驗發現miR-5088-5p能夠抑制Hcy誘導的肝細胞焦亡，但具體機制有待進一步研究，未來研究方向我們會更加關注NLRP3炎癥小體激活后的下游信號通路分子的抑制劑來阻斷焦亡過程，為肝病的防治提供新的思路。