地高辛對人肺癌裸鼠皮下移植瘤與原位移植瘤抗腫瘤作用的比較

王佳南，汪紫易，盧洪勝，陳浩軒，陶玲瓏，王崢濤，陳 晨，汪旭明，胡瓊瑩

(1.臺州學院醫學院，浙江 臺州 318000；2.寧波大學 醫學院，浙江 寧波 315000；3.臺州市中心醫院(臺州學院附屬醫院)，4.臺州市立醫院，浙江 臺州 318000)

肺癌是現在世界上最為常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤相關的死亡原因中占第一位[1]。在中國，肺癌也是最為常見的癌癥，在癌癥相關死亡中占30%[2]。非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最為常見的類型[3]，對于一些早期和局部晚期的NSCLC，手術治療加輔助化療是最佳選擇，但易引起術后復發[1]。強心苷類藥物(地高辛、洋地黃毒苷等)作為臨床上用于治療心力衰竭和心房顫動的常用藥，能夠減少癌癥發生和復發的概率，降低癌癥發生時患者的病死率[4]，具有潛在的抗腫瘤應用前景。近年來，隨著人們對于強心苷類藥物認識的深入，已有部分強心苷類化合物及其衍生物作為抗腫瘤藥物進入了臨床試驗階段[5]。此外，強心苷類藥物與抗腫瘤藥物聯合應用來提高療效理論上也成為一種可能[4]。

選擇合適的動物模型對發展有效的治療疾病的方法或手段至關重要。目前研究肺癌的裸鼠模型主要有皮下移植瘤模型、腎包膜下移植瘤模型、原位移植瘤模型等。基于腫瘤生長、侵襲和轉移的“種子和土壤”學說，腫瘤細胞在體內的生長和擴散具有器官特異性[6]。皮下和腎包膜下移植瘤模型由于腫瘤細胞沒有植入肺中，被認為不能很好地體現臨床轉移特征和反映藥物敏感性[7-8]；而原位移植有助于肺腫瘤細胞保持原有的組織學特征，所以該模型提供的藥代動力學、藥效學特征被認為比皮下或腎包膜下移植瘤模型更能反映肺癌的特征[7-8]。因此，本研究擬構建裸鼠皮下移植瘤模型和裸鼠原位移植瘤模型，以地高辛為例，初步探究其對兩種人肺癌移植瘤模型的敏感性差異及抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 BALB/c-NULL裸鼠，雌性，6-8周齡，(18-20)g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬) 2017-0005，飼養于SPF級動物房，屏障系統的潔凈層流架內，溫度(25±1)℃，相對濕度40%-60%，生長所需的墊料、飼料和飲水均經滅菌處理，每日保持10 h的光照，14 h無光的陰暗周期。開展的實驗均經浙江省實驗動物中心實驗動物福利倫理委員會和臺州學院醫學院醫學倫理委員會審核批準(No ZJCLA-IACUC-20080012、TZYXY2018-003)，符合國家實驗動物倫理相關規定。

1.1.2細胞 NCI-H460細胞，購自上海蓋寧生物科技有限公司；Luc-H460細胞株購于南京福克賽生物科技有限公司。

1.1.3藥物和試劑 地高辛購自成都德思特生物技術有限公司(貨號：DD 0086)；注射用鹽酸吉西他濱購自江蘇豪森藥業集團有限公司(批號：170803)；鼠源p-p38抗體(貨號：sc-166182)、鼠源p-ERK抗體(貨號：sc-136521)購自Santa Cruz；兔源Nur77抗體購自 Cell Signaling Technology(貨號：#3960)； HRP標記山羊抗兔IgG二抗購自上海威奧生物科技有限公司(貨號：WB2177)；免疫組化試劑盒購自北京中衫金橋生物技術有限公司(貨號 ：SP-9000)；異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司(貨號：R510-22)；基質膠購自美國BD BioCoat(貨號：354248)。

1.1.4實驗儀器 Multicut半自動石蠟切片機(德國徠卡)；ASP300S全自動組織脫水機(德國徠卡)；LBP-5196-Ⅱ全自動抗原修復儀(廣州安必平醫藥科技股份有限公司)；Dako Coverstainer全自動染色封片一體機(丹麥安捷倫Dako)；IVIS Lumina LT 小動物活體成像系統(美國珀金埃爾默)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 人肺癌H460細胞于RPMI 1640(含10% FBS，1%鏈-青霉素混合液)培養液中，置37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。胰酶-EDTA消化傳代，2-3 d傳代1次。

1.2.2皮下移植模型 裸鼠適應性喂養1周后，取兩只裸鼠，將對數生長期的H460細胞懸液每只0.2 mL接種至裸鼠右腋后線皮下，待腫瘤長到一定程度，將瘤塊無菌剝離，剪成2×2×2(mm3)的組織小塊，通過套管針，把組織塊接種至裸鼠右腋后線皮下完成造模。造模成功后的裸鼠共30只，分為5組，每6只，分別為對照組(C)、陽性藥吉西他濱120 mg·kg-1組(G)、地高辛(4 mg·kg-1)高劑量組(D-H)、地高辛(2 mg·kg-1)中劑量組(D-M)和地高辛(1 mg·kg-1)低劑量組(D-L)，通過腹腔注射給藥，按0.2 mL/20 g體質量計算藥量，對照組腹腔注射生理鹽水0.2 mL/只，每周給藥2次。每次給藥前測量裸鼠體質量和腫瘤體積(腫瘤長徑(a)和短徑(b)，計算體積[V=(a×b2)/2)]，待對照組瘤塊體積超過2 000 mm3時停止給藥，處死裸鼠，無菌剝離瘤塊。將瘤塊保存于-80 ℃和福爾馬林固定液中，進行病理學檢查。

1.2.3原位移植模型 裸鼠適應性喂養1周后，把消化收集的Luc-H460細胞(H460細胞帶有螢光素酶標記)，稀釋到8×1010個·L-1，按照1 ∶1配比與基質膠混合后備用。裸鼠用異氟烷氣麻，將制備好的Luc-H460細胞懸液直接肺穿刺注射到裸鼠肺部，25 μL/只。飼養一周后，活體成像觀察肺部成瘤情況。造模成功后的裸鼠共40只，分為5組，每組8只，分組及給藥情況同皮下移植模型。每次給藥前測量裸鼠體質量并對裸鼠進行生物發光活體成像。實驗結束后，處死裸鼠，解剖觀察心肝脾肺腎等重要器臟腫瘤病灶，并拍照記錄。分離肺部腫瘤組織。將內臟組織保存于-80 ℃和福爾馬林固定液中，進行病理學檢查。

1.2.4HE染色及免疫組織化學染色 皮下移植瘤組取剝離的瘤塊，常規脫水，經石蠟包埋后切片。HE染色經全自動染色機進行染色、制片，完成后在光學顯微鏡下觀察、拍照。免疫組化檢測將切片脫蠟后置于自動抗原修復儀中98 ℃水煮熱修復25 min，于室溫冷卻，滴加一抗(1 ∶100稀釋)，室溫孵育1 h，滴加二抗(1 ∶100稀釋)，室溫孵育20 min，DAB顯色5 min，蘇木精復染25-30 s，烘干，封片，完成后在光學顯微鏡下觀察p38、細胞外信號調節激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)的磷酸化水平和Nur77的表達情況，并拍照記錄。免疫組化光鏡下黃色或棕黃色顆粒為陽性結果，且黃色或棕黃色顆粒越多，即蛋白的表達水平越高。

2 結果

2.1 皮下移植瘤模型

2.1.1各組小鼠體質量變化 d 14，各組小鼠體質量均下降，其中吉西他濱組小鼠體質量下降最為明顯，下降1.6 g；d 21，吉西他濱組小鼠體質量繼續下降，其余各組小鼠體質量均有回升；d 38，吉西他濱組小鼠體質量最小，為17.2 g，其余各組小鼠體質量范圍為22.0-23.6 g(Tab 1)。統計學分析結果顯示，吉西他濱組小鼠體質量差別較為明顯(P<0.05)，其余各組間小鼠體質量并無差異(P>0.05)。

2.1.2腫瘤體積變化 d 7，各組小鼠的腫瘤體積范圍為81-98 mm3；d 14，地高辛中劑量組瘤體積最小，平均為273 mm3；d 21，吉西他濱組瘤體積最小(平均627 mm3)，小于地高辛中劑量組(平均709 mm3)；d 38，對照組小鼠瘤塊平均體積為2 315 mm3(終止實驗)，吉西他濱組和地高辛高、中、低劑量組小鼠腫瘤體平均積分別為958 mm3、1 677 mm3、1 559 mm3、1 970 mm3，其抑瘤率分別為59%、28%、37%、15%，與35 d時相比，地高辛低劑量組抑瘤率有所下降，其余各組均上升(詳見Fig 1，實驗中實際瘤體積測量頻率為每周兩次)，結果顯示，與對照組相比，吉西他濱組瘤體積差異有顯著性(P<0.05)；地高辛各劑量組腫瘤體積雖較對照組小，但差異并無顯著性(P>0.05),見Fig 2。

Fig 1 Subcutaneous tumor model: Measurement of

Fig 2 Subcutaneous tumor model: Anatomical results of tumor mass in mice

2.1.3HE染色及免疫組化 HE染色法觀察皮下移植瘤各組中裸鼠移植瘤的組織結構，結果顯示，對照組腫瘤細胞未見明顯壞死，細胞排列緊密，密度較大，細胞異型性明顯；地高辛中、高劑量組可見較明顯的細胞壞死和纖維增生，細胞排列密度較對照組降低，吉西他濱組與地高辛低劑量組細胞雖有壞死，但不如前兩組明顯(Fig 3)。

Fig 3 Subcutaneous tumor model: HE staining results：Morphology of transplanted tumor(×400)

Fig 4結果顯示，對照組p38、ERK磷酸化水平低并且僅少量表達Nur77 (<10%)，結果呈陰性；吉西他濱組和地高辛高劑量組p38，ERK的磷酸化水平相近，兩組p-p38的陽性率約為60%，p-ERK的陽性率約為40%；地高辛中、低劑量組的p38、ERK蛋白磷酸化水平則稍高于前兩組，近80%；Nur77的陽性表達，吉西他濱組和地高辛高劑量組則明顯高于地高辛中、低劑量組，約90%。我們的結果顯示吉西他濱也可誘導核受體Nur77表達的增加和活化MAPK信號通路。

Fig 4 Subcutaneous tumor model: Immunohistochemical staining results(×400)(↑ represents a positive result)

2.2 原位移植瘤模型

2.2.1各組小鼠體質量變化 d 7，對照組、吉西他濱組和地高辛高劑量組小鼠體質量上升，其中以吉西他濱組小鼠體質量升高最多，升高1.2 g，地高辛中、低劑量組小鼠體質量下降，且低劑量組小鼠體質量下降較多，下降1.1 g；d 10，各組小鼠體質量均上升，吉西他濱組小鼠體質量達到最高；d 14，地高辛高劑量組小鼠體質量達到最高；d 17，地高辛中、低劑量組小鼠體質量達到最高。統計學結果分析顯示，各組間小鼠體質量并無差異(P>0.05)，(Tab 2)。

2.2.2生物發光活體成像結果 d 10，各組小鼠活體熒光值無顯著差別(P>0.05)；d 20，吉西他濱組與地高辛中劑量組熒光值較小；d 23，吉西他濱組和地高辛高、中、低劑量組小鼠抑瘤率分別為63%、-102%、80%、32%，與20 d時相比，除地高辛低劑量組外，各組抑瘤率均上升；高劑量地高辛反而促進腫瘤生長(Tab 3、Fig 5)。統計學分析結果顯示，與對照組相比，腫瘤接種后20 d時，吉西他濱組和地高辛中劑量組抑瘤效果較為明顯(P<0.05)；接種后23 d時，僅地高辛中劑量組抑瘤效果較為明顯(P<0.05)，地高辛高劑量組反而加重了腫瘤的發展(P<0.05)。

Tab 3 Orthotopic transplantation tumor model: Fluorescence value of in biolumine- scence imaging in mice at different time points(×108, P/S)

Fig 5 Orthotopic transplantation tumor model: In biolumine- scence imaging results of mice

2.2.3腫瘤原位生長及轉移情況 由Fig 6可知，對照組肺部組織被腫瘤浸潤嚴重，正常肺組織極少；吉西他濱組瘤塊大，但小鼠正常肺組織形態結構基本保留；地高辛高劑量組瘤塊比模型組大，正常肺組織被腫瘤侵占所剩無幾；地高辛中、低劑量組瘤塊較小，肺組織相對完整。所有組腫瘤均未出現心、肝、脾、腎的轉移。

Fig 6 Orthotopic transplantation tumor model：Tumor growth and metastasis in situationa: Heart; b:Lung; c:Kidney; d:Liver; e: Spleen; yellow circle marked as tumor tissue

3 討論

近幾十年來，皮下移植人源細胞到免疫缺陷動物一直是臨床前腫瘤實驗的黃金標準。然而，皮下移植瘤模型由于異種移植物的來源和宿主機體微環境之間存在差異，缺乏循環腫瘤細胞和無轉移病灶，在評價藥物時存有很大的風險。考慮到組織特異性和腫瘤微環境的影響，原位移植模型在過去的20年中逐漸發展起來[8-9]，它的轉移率和轉移模式更接近于臨床[8]。本研究中，我們通過建立人肺癌裸鼠皮下移植與原位移植兩種模型，比較吉西他濱和地高辛對兩種肺癌模型抗腫瘤作用的差異。結果表明(Fig 1，5，Tab 3)：在皮下移植模型中，吉西他濱表現出較好的抑瘤效果(P<0.05)，地高辛則沒有表現出較好的抑瘤效果(P>0.05)；而在原位移植模型中，僅有地高辛中劑量組表現出較好的抑瘤效果(P<0.05)，吉西他濱并沒有表現出較好的抑瘤效果(P>0.05)。我們推斷其可能與上述兩種模型之間的差異和藥物本身的特性有關，因此提示我們進行藥效學評價時需要選用合適的模型進行全面評價。例如，HIF-1α拮抗劑px-478顯示對肺癌的皮下移植瘤沒有較好的活性，但卻能抑制原位人小細胞肺癌細胞的擴散和小鼠肺腺癌的惡化和蔓延，并最終進入Ⅰ期臨床試驗[10]。如果僅選用一種模型，會存在一些風險：一是把無療效或療效不顯著的一種藥物或一個藥物組合推向臨床，二是中斷研發有潛能的抗肺癌藥物。本次研究結果顯示，在原位移植模型中，中、低劑量的地高辛有較好的抑制腫瘤生長和浸潤的效果，其效果優于吉西他濱，并且各組小鼠心、肝、脾、腎等重要臟器肉眼均未見損傷，說明地高辛作為抗腫瘤藥物可能有著潛在的應用前景。

在上述比較藥物對不同模型敏感性的基礎上，我們結合其他體外研究結果，利用腫瘤組織探索了吉西他濱和地高辛體內可能的抗腫瘤作用機制，如：是否活化MAPK信號傳導通路，是否上調核受體Nur77的表達。

研究表明MAPK信號通路在細胞凋亡或自噬中發揮舉足輕重的作用。到目前為止，已經在哺乳動物細胞中克隆并鑒定了6個MAPK亞家族，它們是：ERK1/2、ERK3/4、ERK5、ERK7/8、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)1/2/3和p38MAPK (p38α/β/γ/δ)[11]。MAPK信號通路包含3條并行的MAPKs信號通路：ERK信號轉導通路、JNK/SAPK信號轉導通路和p38-MAPK通路[12]。Zhou等[13]的研究解釋了JNK 和p38的激活分別促進Nur77的出核及其在胞質的靶向線粒體并與Bcl-2共定位；而ERK信號通路調節的Nur77磷酸化和線粒體靶向促進了細胞凋亡的發生[14]。Nur77在細胞核中的轉錄激活可能具有促進細胞生長的作用[15]，而一些凋亡誘導劑(順鉑、乙酰紫草素)可通過誘導Nur77的表達和出核后靶向結合線粒體外膜蛋白，通過線粒體途徑觸發凋亡過程[16]。Wang等[17]發現THPN處理促進了原本定位在瘤細胞胞質中的Nur77與線粒體外膜蛋白Nix的結合，進入線粒體內膜后，促進膜孔通道復合體的開放導致線粒體膜電位的喪失，最終誘導不可逆和致死性的自噬。我們的免疫組化結果顯示(Fig 4)，與對照組相比，地高辛各劑量組及吉西他濱組的移植瘤組織p-p38、p-ERK、Nur77蛋白陽性表達率增加，提示強心苷類藥物地高辛和吉西他濱可能通過活化腫瘤組織的p38、ERK蛋白和上調Nur77蛋白的表達來誘導腫瘤細胞凋亡。

本研究中，我們發現強心苷類藥物地高辛在中、低劑量時抑瘤效果較好。我們猜測，地高辛在中低劑量時抑瘤效果較好可能與其作用于Na+-K+-ATP酶(鈉泵)有關。Cherniavsky-Lev等[18]的實驗結果表明，強心苷可引起細胞表面鈉泵的內吞，最終導致細胞生存能力下降。強心苷引起的鈉泵內吞作用在強心苷濃度≤100 nmol·L-1的條件下呈劑量依賴性[18]，這可能解釋了本次實驗結果中強心苷類藥物在中低劑量時抑瘤效果較好，且中劑量抑瘤效果優于低劑量, 詳細的機制還有待探究。

綜上所述，本研究同時建立了兩種肺癌裸鼠移植瘤模型，證明了藥物對不同腫瘤模型的敏感性存在差異，探討了地高辛體內發揮抗肺癌作用的機制，為地高辛等強心苷類化合物用于肺癌治療的可能性提供了理論依據。