HBEGF部分通過LIF上調(diào)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平

梁 博，王新軍，趙 楊，王建業(yè)，周少龍，楊 卓

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 1. 神經(jīng)外科、2.藥學(xué)部，河南 鄭州 450052)

膠質(zhì)瘤屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見腫瘤，發(fā)病率、死亡率都較高，且目前臨床上治療效果不佳[1]。程序性死亡因子配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)水平升高是多種腫瘤細(xì)胞逃避T細(xì)胞殺傷的重要機(jī)制[2]，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，抑制PD-L1上調(diào)可阻斷T細(xì)胞殺傷的敏感性[3]。肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(heparin-binding epidermal growth factor，HBEGF)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)和功能研究于1988年首次報(bào)道，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HBEGF可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)HBEGF mRNA表達(dá)，提示HBEGF可能以自分泌的方式促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展[4]；目前研究發(fā)現(xiàn)，HBEGF表達(dá)與肝細(xì)胞癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的形成有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步確定[5]。白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)與白介素-6類似，作為免疫調(diào)節(jié)因子，可通過自分泌方式影響免疫功能[6]，研究發(fā)現(xiàn)，LIF在前列腺癌細(xì)胞中可能通過激活蛋白酪氨酸激酶1/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3通路上調(diào)PD-L1基因表達(dá)，從而發(fā)揮癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和免疫功能[7]；子宮中HBEGF與LIF存在協(xié)同作用，促進(jìn)子宮內(nèi)膜建立受容性[8]。但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中HBEGF、LIF、PD-L1 三者之間關(guān)系尚不清楚。因此，本研究以U251、U87細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討三者之間的關(guān)系，以期為臨床上治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)分別為：TCHu 58、TCHu 138。一抗LIF、PD-L1、β-actin抗體和GAPDH、HBEGF、LIF中和抗體均購(gòu)自荷蘭Hycult Biotech公司，批號(hào)分別為：HC4537、HC7584、HC1052、HM1022、HM4258、HM2015；HBEGF購(gòu)自美國(guó)Abnova公司，批號(hào)：063201。規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/核酸內(nèi)切酶9(CRISPR/Cas9)基因組編輯技術(shù)構(gòu)建HBEGF基因敲除U251、U87細(xì)胞系(已鑒定，購(gòu)自英國(guó)abcam公司)。

1.2 儀器7500型RT-qPCR儀由美國(guó)ABI公司提供；Tanon 4100型全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)由上海Tanon科技有限公司提供。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組U251使用含10%胎牛血清的改良Eagle培養(yǎng)基、U87使用含10%胎牛血清的低限量Eagle培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)1 ∶3傳代培養(yǎng)，部分細(xì)胞置于液氮中保種，部分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)1：在正常U251、U87細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)分為空白組(NC group，不做處理)、抗GAPDH組(anti-mGAPDH group，添加GAPDH中和抗體)、抗HBEGF組(anti-hHBEGF group，添加HBEGF中和抗體)(正常細(xì)胞密度至90%時(shí)1 ∶3傳代，收集此時(shí)細(xì)胞記為passage 0，添加抗GAPDH組添加終濃度為10 μg·L-1GAPDH中和抗體，抗HBEGF組添加終濃度為10 μg·L-1HBEGF中和抗體培養(yǎng)細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞密度90%時(shí)1 ∶3比例傳代，傳代1次記為passage 1，2次為passage 2，3次為passage 3，檢測(cè)細(xì)胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平)；實(shí)驗(yàn)2：實(shí)驗(yàn)分為空白組(NC group，正常細(xì)胞)、HBEGF對(duì)照組(mock group，正常細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體mock)、HBEGF敲除組(HBEGF KD group，HBEGF敲除細(xì)胞)，分別在上述細(xì)胞基礎(chǔ)上添加HBEGF(HBEGF對(duì)照組使用HBEGF敲除的陰性對(duì)照穩(wěn)定細(xì)胞系，HBEGF敲除組使用敲除HBEGF的細(xì)胞系。5 μL HBEGF質(zhì)粒DNA、10 μL Lipofectamine 2000分別用250 μL無血清、無抗生素細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，室溫靜置15 min后二者混合形成DNA-Lipofectamine 2000混合物，將混合物添加上述空白組、HBEGF對(duì)照組、HBEGF敲除組37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，6 h后更換為完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，不添加DNA-Lipofectamine 2000混合物以及添加DNA-Lipofectamine 2000混合物各組檢測(cè)細(xì)胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平)；實(shí)驗(yàn)3：在HBEGF敲除細(xì)胞系中，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(control group，不做處理)、HBEGF組(HBEGF group，添加HBEGF)、HBEGF+抗GAPDH組(HBEGF+anti-mGAPDH group，添加HBEGF和GAPDH中和抗體)、HBEGF+抗LIF組(HBEGF+anti-LIF group，添加HBEGF和LIF中和抗體)(HBEGF敲除細(xì)胞系中密度至80%時(shí)，HBEGF+抗GAPDH組和HBEGF+抗LIF組分別添加終濃度為10 μg·L-1的GAPDH、HBEGF中和抗體，細(xì)胞傳代3代。除對(duì)照組外，其余各組添加HBEGF DNA-Lipofectamine 2000混合物孵育6 h，更換為對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中PD-L1 mRNA和蛋白水平)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)孔均為6個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中LIF、PD-L1 mRNA水平TRIzol法提取細(xì)胞中總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，RT-qPCR儀檢測(cè)細(xì)胞中HBEGF、LIF、PD-L1 mRNA水平。LIF F 5′-CCGCATAGTCGTGTACCTT-3′、R 5′-ATTTGGGTTTAGCGATGC-3′，PD-L1 F 5′-GGTGGTGCCGACTACAA-3′、R 5′-TAGCCCTCAGCCTGACAT-3′，β-actin F 5′-CCCAGCACAATGAAGAAGATCAA-3′、R 5′-GATCCACACGGAGTACTTG-3′。20 μL反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR qPCR Mix，1 μL cDNA(50 mg·L-1)，F(xiàn)/R(均為10 μmol·L-1)各0.5 μL，8 μL ddH2O；反應(yīng)條件：94 ℃、60 s；95 ℃、30 s，(HBEGF：61 ℃、40 s，LIF：58 ℃、60 s，PD-L1：60 ℃、20 s)，40個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min。2-ΔΔCt法計(jì)算HBEGF、LIF、PD-L1相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中LIF、PD-L1蛋白水平收集細(xì)胞至離心管中，蛋白裂解液冰上裂解細(xì)胞10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心20 min，上清液為收集細(xì)胞總蛋白。每孔上樣蛋白20 μg、上樣體積20 μL，凝膠電泳分離蛋白、經(jīng)聚偏氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉膜2 h后，對(duì)應(yīng)加入一抗LIF、PD-L1、β-actin，4 ℃孵育過夜；加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h；DAB顯色試劑盒避光顯色，全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)拍照和定量分析。

2 結(jié)果

2.1 基于GDC TCGA-GBM數(shù)據(jù)集分析HBEGF、LIF和PD-L1 mRNA相關(guān)性本次包含155例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。通過xena browser獲取GDC TCGA-GBM數(shù)據(jù)集中樣本類型為原發(fā)性膠質(zhì)瘤的樣本中HBEGF、LIF和PD-L1 3個(gè)基因的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。Pearson分析發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中HBEGF與LIF、HBEGF與PD-L1、LIF與PD-L1 mRNA兩兩間均呈正相關(guān)性(r=0.525、0.404、0.501，P均<0.05)，如Fig 1。

Fig 1 Correlation analysis of HBEGF, LIF and PD-L1 mRNA based on GDC TCGA-GBM data set

2.2 HBEGF中和抗體處理對(duì)細(xì)胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平的影響傳代(0、1)代，空白組、抗GAPDH組、抗HBEGF組U251和U87細(xì)胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。傳代2代，在U87細(xì)胞中，分別與空白組、抗GAPDH組相比，抗HBEGF組PD-L1 mRNA和蛋白、LIF蛋白水平降低(P<0.05)。傳代3代，在U251和U87細(xì)胞中，分別與空白組、抗GAPDH組相比，抗HBEGF組LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)。見Fig 2、3,提示HBEGF對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251、U87中LIF、PD-L1表達(dá)起到維持作用。

Fig 2 Effect of HBEGF neutralizing antibody treatment on levels of LIF and PD-L1 mRNA in cells n=6)

Fig 3 Effect of HBEGF neutralizing antibody treatment on levels of LIF and PD-L1 protein in cells n=6)

2.3 敲除HBEGF對(duì)HBEGF蛋白表達(dá)情況及Sanger測(cè)序結(jié)果分別在U251、U87細(xì)胞中敲除HBEGF，敲除HBEGF細(xì)胞中HBEGF蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),見Fig 4。在U251細(xì)胞中，在HBEGF外顯子3中敲除5′-ATTCCAGCCGCCTGTTCTTC-3′，20個(gè)堿基,見Fig 5。

Fig 4 Effect of knocking out HBEGF on levels of HBEGF protein in cells n=6)

Fig 5 Sanger sequencing results of knocking out HBEGF gene in U251 cells

2.4 敲除HBEGF對(duì)細(xì)胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平的影響在U251、U87細(xì)胞中，分別與空白組、HBEGF對(duì)照組相比，HBEGF敲除組細(xì)胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)；在空白組、HBEGF對(duì)照組、HBEGF敲除組中添加HBEGF后，LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)。Fig 6、7提示，敲除HBEGF后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251、U87中LIF、PD-L1表達(dá)降低，而添加HBEGF后可促進(jìn)LIF、PD-L1的表達(dá)。

2.5 LIF中和抗體處理對(duì)HBEGF處理HBEGF敲除細(xì)胞中PD-L1的影響與對(duì)照組相比，HBEGF組PD-L1 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)；與HBEGF組、HBEGF+抗GAPDH組相比，HBEGF+抗LIF組PD-L1 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)，見Fig 8、9。提示LIF中和抗體處理可部分削減HBEGF處理對(duì)HBEGF敲低的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的誘導(dǎo)作用，HBEGF誘導(dǎo)LIF是HBEGF誘導(dǎo)并維持PD-L1表達(dá)的一個(gè)中間過程。

3 討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最惡性腫瘤，具有高度異質(zhì)性，由腫瘤細(xì)胞及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤干細(xì)胞組成，這些細(xì)胞易存在耐藥性且存在腫瘤復(fù)發(fā)性，治療具有一定難度。臨床上常用藥物為替莫唑胺，替莫唑胺作為一種烷基化學(xué)治療劑，可誘導(dǎo)DNA鏈斷裂，但使用患者通常表現(xiàn)出耐藥性，為治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增加難度[9]。免疫治療顛覆傳統(tǒng)治療方法，成為目前研究熱點(diǎn)，可以提高血液中T細(xì)胞比例，延長(zhǎng)中位生存時(shí)間，具有巨大潛力，但仍處于初步階段[10]。PD-L1作為一種重要的免疫抑制蛋白，可在癌細(xì)胞中高表達(dá)，通過細(xì)胞介導(dǎo)癌細(xì)胞免疫逃逸。PD-L1或PD-1或二者的特異性阻斷劑可恢復(fù)T細(xì)胞功能并導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡，但受腫瘤異質(zhì)性以及腫瘤微環(huán)境影響，在許多類型的實(shí)體瘤中，PD-L1免疫抑制檢查點(diǎn)治療受到限制[11]。

HBEGF具有與表皮生長(zhǎng)因子(epithelial growth factor，EGF)相似的生物活性，可促進(jìn)細(xì)胞分裂、促進(jìn)癌細(xì)胞存活或生長(zhǎng)，參與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、入侵過程，且分布廣泛，可作為臨床上靶向因子，是臨床上惡性腫瘤治療的新途徑[12]。HBEGF可能以自分泌的方式促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展[13]?？笻BEGF抗體作為活性成分的癌癥治療劑和增殖抑制劑，可用于治療胃癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、腦瘤等多種癌細(xì)胞，抗HBEGF抗體對(duì)于癌細(xì)胞增殖、遷移、浸潤(rùn)具有強(qiáng)烈的抑制作用，且已申請(qǐng)專利；在結(jié)腸癌中，EGF促進(jìn)結(jié)腸癌干細(xì)胞中PD-L1的產(chǎn)生和運(yùn)輸[14]。LIF是一種多生物學(xué)功能趨化性細(xì)胞因子，為白介素-6家族成員之一，因最早發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)小鼠M1型白血病細(xì)胞分化并抑制其增殖而命名[15]，具有廣泛的生物學(xué)活性，在膠質(zhì)瘤中作為生長(zhǎng)因子，其水平升高可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化[16]。且LIF調(diào)控PD-L1的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤遷移、侵襲過程[17]。本研究通過分析GDC-TCGA GBM數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，HBEGF基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的mRNA表達(dá)水平與PD-L1及LIF的mRNA表達(dá)水平，顯示HBEGF與LIF正相關(guān)系數(shù)為0.525、HBEGF與PD-L1正相關(guān)系數(shù)為0.404、LIF與PD-L1正相關(guān)系數(shù)為0.501，P均<0.000 1，相關(guān)系數(shù)在0.3-0.7之間具有良好的相關(guān)性，且與PD-L1相比，LIF與HBEGF相關(guān)性更強(qiáng)；與HBEGF相比，LIF與PD-L1相關(guān)性強(qiáng)，提示HBEGF與LIF關(guān)系緊密通過PD-L1發(fā)揮作用。HBEGF中和抗體處理后U251、U87細(xì)胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加而逐漸降低，提示HBEGF通過自分泌方式影響LIF、PD-L1的表達(dá)。敲除HBEGF后可顯著降低LIF、PD-L1 mRNA和蛋白的表達(dá)，而進(jìn)一步添加HBEGF后LIF、PD-L1 mRNA和蛋白表達(dá)升高，提示HBEGF處理可顯著恢復(fù)HBEGF敲低的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PD-L1和LIF的表達(dá)水平。LIF中和抗體處理后PD-L1水平降低，提示HBEGF處理后升高的PD-L1水平可被LIF中和抗體降低，但卻不能完全改變PD-L1。以上結(jié)果顯示，HBEGF可能部分通過誘導(dǎo)LIF表達(dá)/分泌來維持膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中PD-L1的表達(dá)水平。

綜上所述，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，HBEGF部分通過LIF上調(diào)PD-L1的表達(dá)，本文首次驗(yàn)證了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中HBEGF、LIF、PD-L1 三者之間的關(guān)系，為臨床上治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤提供一定參考。