FOXA2改善肝內膽汁淤積伴高脂血癥小鼠肝臟功能和血脂水平

張夢潔，楊 洋，陳 慧，陳思聰，翟華立，楊曉明,，于 淼,，焦 軼

(1.安徽醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室，安徽 合肥 230032；2.軍事科學院軍事醫學研究院生命組學研究所,蛋白質組學國家重點實驗室，北京 100850)

叉頭框蛋白A2(forkhead box A2，FOXA2)是肝臟中重要的轉錄因子，通過高度保守的翼狀螺旋結構域以單體形式結合在靶基因啟動子區的DNA序列上[1]。FOXA2與其它肝細胞核因子(hepatocyte nuclear factors，HNFs)協同調控大量肝臟功能基因的表達，包括血漿蛋白、載脂蛋白、凝血因子、以及葡萄糖、脂肪酸、氨基酸代謝中的關鍵代謝酶，參與肝臟發育、器官形成、代謝和穩態維持等多種生物學過程[2]。由于神經管發育異常，FOXA2全身敲除小鼠胚胎致死；在肝細胞中特異性敲除FOXA2不會影響小鼠發育，但是會導致肝臟膽汁酸代謝穩態失衡，增加小鼠對高膽酸飲食損傷的敏感性，主要原因是FOXA2調控的多種參與膽汁酸代謝的基因表達異常[3]。FOXA2還可以通過將cAMP響應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)和糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)募集到染色體上調節糖異生過程[4]。利用重組腺病毒在小鼠體內過表達FOXA2可以通過調節脂質β氧化改善高脂飲食小鼠以及瘦素敲除小鼠胰島素抵抗[5]。臨床研究顯示，在原發性硬化性膽管炎患者以及膽道閉鎖患者的肝臟中，FOXA2表達明顯下調[6]。FOXA2的表達也與腫瘤的發生發展密切相關，在肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、甲狀腺癌以及大腸癌患者體內FOXA2表達明顯下調[7]。FOXA2表達也受自身調節，在FOXA2啟動子上游-138 bp--126 bp存在肝細胞核因子6的識別位點；在大鼠子宮中，Hedgehog蛋白參與FOXA2的表達調控；在卵巢癌細胞中，miR-590-3p通過與FOXA2的3‘-UTR區結合抑制其表達[8]；然而，目前關于FOXA2自身的表達調控研究相對較少，仍需要進一步研究。

膽汁淤積(cholestasis)是指膽汁合成、分泌和排泄障礙引起肝臟以及血液循環中膽汁過度堆積，慢性膽汁淤積患者通常會并發肝功能失調以及高脂血癥[9]。熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)是目前治療膽汁淤積性肝病的首選藥物[10]，但藥效局限于疾病早期，需要研究人員尋找新的治療靶點。鑒于FOXA2在肝臟膽汁酸代謝中的重要作用，我們通過尾靜脈高壓注射在小鼠體內過表達FOXA2，觀察FOXA2對高膽固醇/膽酸飼料(cholic acid diet，CAD)誘導的肝內膽汁淤積小鼠肝臟功能及血脂水平的影響，以期為肝內膽汁淤積肝病的臨床治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康野生型C57BL/6J小鼠，雄性，8周齡，體質量(20±2) g，購買自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于SPF級動物實驗室，飼喂保持晝夜節律，期間自由攝取水和食物。動物生產許可證編號：SCXK(京)2016-0006；本研究中所有動物實驗均通過軍事醫學研究院實驗動物管理與使用委員會批準(IACUC-DWZX-2020-598)。

1.1.2實驗儀器 高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技)；電泳儀設備、酶標儀(美國BIO-RAD公司)；病理切片全景掃描儀(匈牙利3DHISTECH)；RT-PCR儀、PCR儀、高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司)。

1.1.3實驗試劑 CA飼料(TP06108，南通特洛菲飼料公司)； Lamin A/C抗體(A19524，ABclonal公司)；單克隆抗-FLAG?M2小鼠抗體(F-1804，Sigma公司)；FOXA2抗體(sc-374375，Santa公司)；FOXA2-flag質粒由本實驗室構建；轉染試劑(MIR5340，Mirus公司)；組織TCHO酶法測定試劑盒(E1015，北京普利萊公司)；小鼠TBA酶聯免疫試劑盒(SY-E02319,上海雙贏生物公司)；RNA TRIzol(T9424，Sigma公司)；SYBR?Green Real time PCR Master Mix(貨號：QPK-201，ToYoBo公司)；質粒小提試劑盒(貨號：DP103,TIANGEN公司)；反轉錄試劑盒(貨號：C4360，Promega公司)；北京洛奇生物醫學檢驗中心提供血生化指標測定；上海生工生物工程有限公司合成實驗涉及的PCR引物，引物序列如下：Primer(5′-3′)

FOXA2-Forward CCCTACGCCAACATGAACTCG;FOXA2-Reverse GTTCTGCCGGTAGAAAGGGA；TBP-Forward GCTCTGGAATTGTACCGCAG；TBP-Reverse CTGGCTCATAGCTCTTGGCTC；SHP-Forward GACCTGTCACTCTCGGTATCG；SHP-Reverse AGGGCTTGGATGATTCTAGTCA；NTCP-Forward CAAACCTCAGAAGGACCAAACA；NTCP-Reverse GTAGGAGGATTATTCCCGTTGTG；CYP7A1-Forward GGGATTGCTGTGGTAGTGAGC；CYP7A1-Reverse GGTATGGAATCAACCCGTTGTC；CYP8B1-Forward CCTCTGGACAAGGGTTTTGTG；CYP8B1- Reverse；GCACCGTGAAGACATCCCC；BSEP-Forward TCTGACTCAGTGATTCTTCGCA；BSEP- Reverse CCCATAAACATCAGCCAGTTGT； NTCP2- Forward GTCTGTCCCCCAAATGCAACT； NTCP2- Reverse CACCCCATAGAAAACATCACCA； OSTA- Forward CAGCGGGCATGGTCACTATC； OSTA- Reverse CCGTCCACGCTAAGCACTG； OSTB-Forward AGATGCGGCTCCTTGGAATTA；OSTB-Reverse TG GCTGCTTCTTTCGATTTCTG；MRP2-Forward GTG TGGATTCCCTTGGGCTTT；MRP2-Reverse CACAA CGAACACCTGCTTGG；MRP3-Forward CTGGGTC CCCTGCATCTAC；MRP3-Reverse GCCGTCTTGAG CCTGGATAAC；MRP4-Forward AGGAGCTTCAAC GGTACTGG；MRP4-Reverse GCCTTTGTTAAGGAG GGCTTC。

1.2 方法

1.2.1實驗分組 將48只8周齡♂的C57BL/6J小鼠分組。18只小鼠給予正常飼料，其中5只飼喂前給予尾靜脈高壓注射FOXA2-flag質粒(ND+FOXA2組)，5只飼喂前給予尾靜脈高壓注射空白對照載體質粒(ND+Mock組)，其余8只小鼠不作其他處理(ND組)。30只小鼠給予CAD飼料，其中5只飼喂前給予尾靜脈高壓注射轉染質粒(CAD+FOXA2組)，5只飼喂前給予尾靜脈高壓注射空白對照載體質粒(CAD+Mock組)，其余20只小鼠不作其他處理(CAD組)。

1.2.2CAD模型建立[3]每日定時定量給予每只小鼠CA飼料5 g，連續7 d，因CA飼料易氧化，故每日更新飼料。于造模1、3、5、7 d時隨機選取5只小鼠，每組小鼠放入代謝籠中禁食16 h后稱質量，脫頸處死，摘眼球取血，取膽囊、肝臟，拍照稱質量。

1.2.3小鼠尾靜脈高壓注射法轉染質粒 取20 μg質粒稀釋至200 μL體積，混勻后靜置5 min，加入2 mL轉染試劑，混勻后室溫靜置15 min，通過尾靜脈在5-8 s內將混合物注入小鼠體內。ND+Mock組、CAD+Mock組注射空白對照載體質粒，ND+FOXA2組、CAD+FOXA2組注射FOXA2-flag質粒。

1.2.4血清檢測 摘除小鼠眼球取血，抗凝管中的血液室溫沉淀2 h，置于4 ℃離心機，3 000g離心20 min，分離血液上清，采用全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST、TCHO、LDL-C、HDL-C及TBA含量。

1.2.5病理學檢測 小鼠處死后取肝臟稱質量，切取肝臟最大葉部分組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片進行HE染色；切取塊狀肝組織液氮速凍，冰凍切片包埋后用于油紅O染色；病理切片全景掃描觀察肝組織損傷情況。

1.2.6蛋白印跡檢測 取小鼠肝臟組織約20 mg，加入200 μL RIPA裂解液，充分勻漿后取上清液，進行蛋白定量。配制10% SDS-PAGE凝膠，進行電泳分離、電轉，封閉2 h；4 ℃孵育第一抗體(FLAG，1 ∶1 000稀釋；FOXA2，1 ∶400稀釋)過夜；洗膜；常溫孵育第二抗體(anti-mouse，1 ∶4 000稀釋)40 min，加入顯色液后進入暗室顯影定影。

1.2.7實時熒光定量PCR檢測 將10-20 mg新鮮小鼠肝組織放入1 mL TRIzol試劑中提取總RNA，取1 μL RNA按試劑盒說明書進行逆轉錄。用Applied Biosystems Quant Studio 3實時PCR系統和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行RT-PCR。反應條件如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃，40 s，40個循環。以TBP為內參，檢測與膽汁酸代謝轉運相關基因。根據2-ΔΔCT方法計算差異表達。

2 結果

2.1 CAD飼喂1周對小鼠體質量、肝臟及膽囊的影響隨著CAD飼喂時間延長，CAD組小鼠體質量呈下降趨勢，在d 7時小鼠體質量較飼喂前明顯下降(P<0.01, Fig 1A)；肝體比呈上升趨勢，d 7時肝體比較飼喂前明顯增加(P<0.01, Fig 1B)；膽囊逐漸增大，d 7的膽囊質量較飼喂前明顯增加(P<0.05, Fig 1C,D)。

2.2 CAD飼喂1周對小鼠肝臟組織結構、脂質積累、肝功及血脂的影響正常飲食下，小鼠肝臟組織HE染色顯示肝細胞形態結構完整。采用CAD飼喂1周后，小鼠肝組織結構松散，可見炎細胞浸潤水腫。油紅O染色結果顯示，CAD組小鼠肝組織出現明顯的脂類物質積累，提示脂質代謝出現異常(Fig 2A)。與ND組小鼠相比，CAD飼喂1周后小鼠血清轉氨酶ALT及AST均明顯升高(P<0.01)，提示出現肝損傷；血清和肝臟中的膽汁酸TBA水平均明顯升高(P<0.01)，提示小鼠肝臟膽汁淤積嚴重；血清和肝臟膽固醇(TCHO)含量均升高(P<0.05，P<0.01)、肝臟甘油三酯(TG)含量明顯升高(P<0.01)，血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高(P<0.05)，提示出現高脂血癥(Fig 2B)。

Fig 2 Liver damage and abnormal lipid metabolism in mice with cholestasis induced by CA n=5)

2.3 FOXA2在CAD小鼠肝臟中表達下調通過Western blot檢測FOXA2的表達，結果顯示，與ND組相比，CAD組FOXA2表達明顯下調(Fig 3A)，通過Real-time PCR檢測FOXA2在轉錄水平的變化，發現CAD小鼠肝臟中FOXA2的mRNA水平也明顯降低(P<0.01, Fig 3B)。

Fig 3 Down-regulation of FOXA2 in liver of CAD n=5)

2.4 過表達FOXA2減輕CAD小鼠肝損傷及脂質積累前期研究表明,肝細胞特異性敲除FOXA2小鼠進食CAD后，可出現肝內膽汁酸淤積、內質網應激和肝損傷[3]。為研究FOXA2在CAD小鼠模型中發揮的作用，我們利用尾靜脈高壓注射法將FOXA2-flag質粒轉染入小鼠體內，使得質粒通過肝門靜脈直接進入肝臟細胞，在肝臟中過表達FOXA2，隨后用CAD飼喂1周，觀察過表達FOXA2對小鼠肝臟和血脂的改變。通過Western blot證明注射FOXA2-flag質粒的小鼠肝臟中檢測到FOXA2-flag表達(Fig 4A)。肝組織油紅O染色結果顯示過表達FOXA2可明顯減輕CAD小鼠的脂質積累情況(Fig 4B)。正常飲食下，過表達FOXA2對小鼠血清轉氨酶、膽汁酸、血脂、肝臟脂質以及肝臟膽汁酸水平無明顯影響。而CAD飼喂1周后，過表達FOXA2可以明顯降低小鼠血清中ALT、AST、TBA、TCHO、LDL-C(P<0.01)水平；肝臟中的膽汁酸(P<0.01)、膽固醇(P<0.05)、甘油三酯(P<0.01)水平也明顯降低(Fig 4C)。提示FOXA2過表達可改善CAD飼喂小鼠的肝損傷，減輕膽汁酸淤積及脂質積累。

2.5 FOXA2調控與膽汁酸合成轉運相關基因FOXA2已經被證實通過直接調控胰島素信號通路以及膽汁酸代謝相關基因的表達來影響機體脂代謝和維持膽汁酸穩態[11]。我們通過Real-time PCR檢測過表達FOXA2對CAD小鼠膽汁酸代謝相關基因的影響，結果顯示，與對照組相比，FOXA2過表達上調參與膽汁酸合成的基因SHP、CYP7A1、CYP8B1的表達，參與膽汁酸轉運的基因NTCP、NTCP2、BSEP、OSTA、OSTB、MRP2、MRP3、MRP4也出現上調趨勢(Fig 5),提示FOXA2過表達可促進肝臟膽汁酸合成，維持膽汁酸正常轉運代謝，有利于分解肝臟累積的膽固醇，減輕肝臟內膽汁淤積。

Fig 5 Genes related to bile acid synthesis and transport regulated by n=5)

3 討論

膽汁酸主要在肝臟中由膽固醇合成，在脂肪的消化吸收和膽固醇代謝中發揮重要作用。然而當膽汁酸代謝異常時，肝細胞內的膽汁酸濃度過高會導致肝細胞毒性、肝損傷和肝內膽汁淤積。

前期研究發現在臨床膽汁淤積性肝病患者肝臟中FOXA2表達明顯下調[3]。在本研究中，我們通過給小鼠飼喂添加膽酸的飼料構建肝內膽汁淤積模型，文獻研究[12]顯示飼料中添加CA會引起肝臟單細胞壞死，通常用來模擬膽汁淤積、膽汁酸代謝障礙來探究膽汁酸轉運蛋白與膽汁酸毒性之間的相互作用。本研究通過給予8周齡野生型C57BL/6J小鼠一周CA飲食，發現小鼠血清和肝臟中膽汁酸水平明顯升高，肝組織病理出現大量炎癥細胞且出現局部壞死，說明我們建模成功。我們的檢測結果也發現CAD小鼠肝臟中FOXA2的mRNA水平和蛋白質水平均明顯降低，與文獻報道一致，因此提出科學假設：如果外源性注射FOXA2質粒使肝細胞過表達FOXA2，是否可以緩解高膽酸飲食誘導的膽汁淤積性肝損傷？于是我們利用水動力學原理在小鼠體內轉染FOXA2質粒，該法主要取決于注射體積和注射速率，當注射速率超過心輸出量時，下腔靜脈中的溶液會積聚，并且在下腔靜脈中產生高的靜水壓力，這種靜水壓迫使注射溶液將以與正常循環相反的方向被迫進入肝臟，使得DNA分子在與血液混合之前直接暴露在肝細胞中。該方法轉染效率較高，是外源基因在動物體內導入和表達的有效手段[13]。結果顯示，與對照組相比，過表達FOXA2組血清轉氨酶降低，炎癥損傷減輕，肝臟和血清中膽汁酸、膽固醇水平降低，脂質積累減輕，明顯改善了CAD飼喂小鼠的肝功能和血脂情況，說明我們的策略可以逆轉由于CAD飼喂造成FOXA2下調后對小鼠肝臟膽固醇代謝的影響。

為了確定過表達FOXA2如何調控小鼠肝臟中膽汁酸代謝，我們通過實時定量PCR檢測了膽汁酸合成及轉運蛋白的mRNA水平。前期研究結果已知膽汁酸代謝分為初級、次級膽汁酸的生成以及腸肝循環[14]。膽固醇經膽固醇-7α-羥化酶(CYP7A1)催化生成膽酸(CA)和鵝去氧膽酸(CDCA)，CYP7A1是膽汁酸合成途徑中的限速酶，決定膽汁酸生成量，通常75%的膽汁酸通過該經典途徑產生。膽汁酸在肝臟中合成后主要由膽鹽輸出泵(BSEP)轉運蛋白輸入膽小管[15]，小部分膽汁酸經過多藥耐藥性相關蛋白2(MRP2)運輸至膽囊中。進食后，膽囊收縮將膽汁排入腸道中，在回腸通過膽汁酸轉運體(ASBT)主動重吸收入小腸黏膜細胞，腸道中的膽汁酸經過MRP家族相關轉運蛋白運輸后通過門靜脈運輸回肝臟中，在鈉/膽汁酸共轉運蛋白(NTCP)、有機溶質轉運蛋白Alpha(OSTA)和有機溶質轉運蛋白Beta(OSTB)的運輸下，膽汁酸被肝細胞重新吸收，膽汁酸的腸肝循環需要多種轉運蛋白協同合作，在此過程中，膽汁酸被充分利用，發揮促進脂類消化吸收的作用[16]。在本研究中，通過對膽汁酸合成基因蛋白的檢測，發現過表達FOXA2后，負責膽汁酸合成的基因(SHP、CYP7A1、CYP8B1)表達增多，參與膽汁酸轉運的基因(NTCP、NTCP2、BSEP、OSTA、OSTB、MRP2、MRP3、MRP4)的表達也明顯上調，在膽汁酸代謝中膽汁酸轉運蛋白發揮重要作用，在此過程中，FOXA2過表達促進膽汁酸合成和轉運，分解肝臟累積的膽固醇，減輕膽汁淤積性肝病誘發的高脂血癥，FOXA2在此過程中的具體調控機制有待進一步研究。

本文通過觀察FOXA2對肝內膽汁淤積小鼠肝臟功能及血脂水平的影響為膽汁淤積性肝病伴高脂血癥疾病機制探索及藥物研發提供了參考。