高尿酸血癥輕度認知功能障礙模型大鼠腸道菌群變化

穆卡然·艾買江，吳美薇，李 娜，何彭可，李佳川，邵曉妮

(西南民族大學藥學院，四川 成都 610041)

高尿酸血癥是一種臨床常見的代謝性疾病，由嘌呤代謝紊亂或體內尿酸(uric acid, UA)排泄減少引起。研究表明，高尿酸血癥除了引起痛風外，還與多系統疾病如腎臟、內分泌、心血管和腦血管疾病密切相關[1]。UA持續性升高對于多種神經退行性疾病的發生發展同樣起到關鍵作用，是認知功能障礙的危險因素[2]。因此，闡明高尿酸血癥輕度認知功能障礙的機制，對其防治具有重要意義。

高尿酸血癥與認知功能障礙的關系近年受到高度關注。認知功能是廣泛的腦功能，包括感知、思維、注意力、記憶等。它是客觀反映腦功能的指標之一，也是生活質量評估的指標[3]。大量研究報道在臨床與動物模型中，UA可參與刺激血管平滑肌增生、血管炎、血管內皮功能受損和氧化應激，并可直接促進動脈粥樣硬化的形成，從而加速血栓形成，并引起各種心血管疾病[4]。認知功能障礙患者黑質密實區多巴胺能神經元的減少與線粒體功能障礙，氧自由基的毒性作用和氧化應激密切相關[4]。因此，可將血清尿酸(serum uric acid，SUA)水平作為輕度認知功能障礙患者疾病進展為癡呆的一個獨立預測因素，但最終發展為輕度認知功能障礙的具體作用機制在很大程度上依然難以闡明。而近期有研究表明，長期高尿酸飲食會造成機體炎癥水平增加，同時還對腸道菌群存在一定不良影響[5]。不同的飲食模式可以塑造不同特征的腸道菌群，高尿酸飲食所誘導的腸道菌群紊亂可能是引起輕度認知功能障礙發病機制的之一[6]。

腸道菌群可參與機體的營養吸收、生長發育、新陳代謝、免疫調節和衰老等活動，在維持機體健康中發揮著重要作用[7]。飲食是影響腸道菌群組成的重要因素，高果糖飲食、高脂肪飲食、高嘌呤飲食和高草酸鹽飲食誘導的高尿酸血癥模型中，腸道菌群的組成發生顯著變化。黃勝南等[8]發現高嘌呤飲食可以引起鵪鶉腸道菌群的結構及其代謝產物發生顯著變化。近年來，人們逐漸開始關注腸道菌群與神經退行性疾病的關系[9]。研究表明，腸道微生物能通過“微生物-腸-腦”軸影響大腦神經生化和行為表型，進而影響認知功能[10]。越來越多的藥物作用機制研究中也將腸道菌群作為靶點進行深入探討，但目前針對高尿酸血癥輕度認知功能障礙的腸道菌群變化仍少有探究。

本研究通過對高尿酸血癥輕度認知功能障礙模型大鼠進行相應的模型評價，并采用16S rDNA測序法研究模型大鼠的腸道菌群的變化,為闡釋其分子機制及制定相關防治措施提供重要參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取Wistar ♂大鼠，SPF級。動物許可證號[SCXK(京)2016-0006]，體質量為(180-220)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。飼養溫度(20-24)℃、相對濕度45%-65%，12 h白天和12 h黑夜循環照明，自由飲食和飲水。正式實驗開始前適應性喂養7 d。所有動物實驗方案均經過西南民族大學動物倫理委員會審核批準，所有實驗操作均嚴格按照實驗動物倫理相關規定進行。

1.2 儀器EthosVision 7.0水迷宮視頻跟蹤分析系統(荷蘭Noldus公司)；7020全自動血生化分析儀(日本Hitachi公司)；Biofuge 22R高速低溫離心機(德國Heraeus sepatech)；PCR儀(ABI GeneAmp?9700型)；DYY 6C電泳儀(北京市六一儀器廠)；Illumina Miseq高通量測序儀(Illumina公司)。

1.3 藥品與試劑UA、氧嗪酸鉀(南京康滿林化工實業有限公司)；SUA血生化試劑盒(四川邁克生物科技股份有限公司)；糞便基因組DNA提取試劑盒(116560-200, 美國MP Biomedical公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1模型的建立 Wistar大鼠適應性喂養7 d結束后，為消除動物個體之間差異，根據體質量將大鼠隨機分為2組，每組8只。分別為空白對照組(control)和高尿酸血癥模型組(hyperuricemia)。模型組大鼠飼喂含2%尿酸和2%氧嗪酸鉀的高尿酸復合飼料，空白對照組大鼠飼喂生長維持飼料，連續飼喂12周。

1.4.2模型的評價 模型構建成功后，觀察各組大鼠皮毛的色澤和自主活動行為。本研究參考相應文獻，利用Morris水迷宮對大鼠學習記憶能力進行評估。訓練階段：將大鼠頭朝池壁，隨機將其放入水中，選擇東、西、南和北四個象限之一。記錄老鼠發現隱藏的水下平臺的時間。訓練后如果時間超過60 s，則將大鼠引導到平臺上，讓大鼠在平臺上停留10 s，將其取出、擦干，然后放回籠中。每只大鼠每天訓練4次，兩次訓練之間的間隔為30 min，需要連續訓練 5 d[14]。測試階段：訓練后的d2，將平臺移開，進行60 s的測試訓練，并將測試大鼠從原始訓練平臺的象限的相反方向放入水中。記錄在目標象限中，即最初放置平臺的象限所需的時間，而逃逸潛伏期用作學習和記憶能力的指標。用視頻跟蹤分析系統記錄大鼠的逃逸潛伏期。

1.4.3樣本采集 Morris水迷宮試驗后，禁食12 h，用10%水合氯醛麻醉大鼠，從腹主動脈取血，在室溫下靜置30 min，并在3 500 r·min-1下離心15 min。取血清，將其轉移到EP管中。同時，收集大鼠糞便，將它們放在無菌的冷凍保存管中，并將其儲存在液氮中，隨后轉置于-80 ℃冰箱保存，待測。

1.4.4糞便菌群基因組DNA提取與檢測 從每組中取適量的大鼠糞便，并使用糞便基因組DNA提取試劑盒提取大鼠糞便cDNA。檢測DNA濃度和純度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量并儲存于-80 ℃用于PCR擴增。

1.4.5PCR擴增及高通量測序 糞便中微生物總DNA經瓊脂糖凝膠電泳檢驗后合格即進行PCR擴增反應，對16S rDNA基因中的V3-V4區域片段進行PCR擴增。利用通用引物342F (5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行PCR擴增。擴增條件：98 ℃預變性 2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，25次循環；72 ℃再延伸 5 min。對于每個樣本，分別加上7 bp的標簽序列。擴增體系(25 μL)：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP (2.5 mmol·L-1) 2 μL，引物：(10 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA Polymerase 0.25 μL，10 ℃ 25-30循環。對目標條帶進行擴增產物回收純化、熒光定量，熒光定量染料為Quant-iTPicoGreen dsDNA Assay Kit。將純化后的擴增子等量混合，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，檢測合格后，使用Illumina MiSeq平臺測序，所得原始數據經拼接、過濾得到目標序列。

1.4.6數據分析與處理 原始測序序列使用QiiME刪除嵌合序列。隨后，使用QiiME算法包中的Uclust對所有序列進行聚類，并選擇代表性的OTU序列。基于Silva數據庫(https://www.arb-silva.de/)對測序結果進行比較和分析，獲得OTU的家族和屬注釋。將OTU結果分類后，對各個樣本和分組在不同層次界(kingdom)、門(phylum)、 綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)、種(species)的菌種豐度進行展示。

1.4.7腸道菌群功能預測 使用PICRUSt標準化消除物種基因組中16S標記基因的拷貝數的影響；通過每個OTU對應的green gene id，獲得COG(cluster of orthologous groups)家族信息和對應OTU信息的KEGG ortholog(KO)；并計算每個COG和KO的豐度。根據COG數據庫中的信息，從eggNOG數據庫中解析出每個COG的描述和功能信息，從而獲得功能豐富度譜；根據KEGG數據庫中的信息，可獲得KO，pathway和EC信息，并根據OTU豐富度功能類別來計算每個信息。

2 結果

2.1 高尿酸血癥大鼠模型的建立高尿酸復合飼料飼喂大鼠12周后，血生化指標測定結果顯示高尿酸血癥組SUA水平明顯高于正常對照組[高尿酸血癥組：(246.54±38.72) μmol·L-1，正常對照組：(74.62±13.24) μmol·L-1，且P<0.05]，表明高尿酸血癥模型構建成功。

2.2 高尿酸血癥大鼠產生輕度認知功能障礙Morris水迷宮適應期大鼠均毛發柔順光亮，自主活動較多，造模結束后，隨著測定天數的增加，兩組大鼠尋找水下隱藏平臺的逃逸潛伏期均縮短。與正常對照組相比，高尿酸血癥組的大鼠的逃逸潛伏期相對較長(Fig 1A)，以及目標象限停留時間較短(Fig 1B)，表明高尿酸血癥誘導大鼠產生輕度認知功能障礙。

Fig 1 Results of Morris water maze test n=7)

2.3 序列長度兩組大鼠糞便中菌群序列均分布在400-500 bp內，與16S rDNA V3-V4區序列長度大致吻合，表明該樣本可用于后續分析。

2.4 OTU劃分和分類地位鑒定此研究中，RDP classifier用于對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，然后與Silva數據庫進行比較，并在每個分類級別進行比較：界、門、綱、目、科、屬、種統計各樣本的群落組成。大鼠糞便樣本共獲得界：1個；門：15個；綱：28個；目：46個；科：93個；屬：307個；種：133個。

2.5 腸道菌群16S rDNA基因測序深度評估Alpha多樣性是指一個特定區域或者生態系統內的多樣性[7]。Chao1值越大表明物種總數越多。Observedotus是統計了群落中特征OTU的數量，Observedotus值越大，表明物種總數越多。PD whole tree是用來描述系統發育多樣性的指數，PD whole tree值越大，表明系統發育多樣性越高。同樣Shannon和Simpson值越大，表明群落多樣性越高。大鼠糞便樣品的所有稀釋曲線(rarefaction curve)(Fig 2)。本研究中稀釋曲線趨勢平坦，表明測序數據合理，測樣深度可靠。

Fig 2 Chao1, Observed, PD whole tree, Shannon and Simpson curves OTUs (operational taxonomic units) clustered at 97% sequence identity of all samples

2.6 腸道菌群多樣性分析微生物多樣性的研究可以通過單個樣品的Alpha多樣性分析或通過Beta多樣性來反映微生物群落的豐富度和多樣性。PCoA(principal co-ordinates analysis)主要用于研究數據可視化方法的相似性或差異性，可用于觀察個人或群體之間的差異。對一系列特征值和特征向量進行排序后，選擇前幾個特征值作為距離矩陣中最重要的坐標。結果以數據矩陣的3D形式顯示(Fig 3)。每個點代表一個樣本。兩點之間的距離越近，兩者之間的社區組成差異就越小。

Fig 3 The principal co-ordinates analysis of all samples

2.7 腸道菌群差異菌屬篩選及群落結構分析本研究中，LEfSe使用線性判別分析(LDA)來估計每種物種的豐度對差異效應的影響。LDA分析的主要目的是尋找在物種之間的豐度上具有顯著差異的物種。與對照組相比，高尿酸血癥輕度認知障礙大鼠糞便樣本中的菌群和屬水平分析如Fig 4所示。門水平上，糞便各組樣本中主要的門分類水平有：厚壁菌門(Firmicutes)、軟壁菌門(Tenericutes)和變形菌門(Proteobacteria)。厚壁菌門占據門水平中的主要比例，軟壁菌門次之。屬水平上，按所占比例依次為丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、厭氧原體屬(Anaeroplasma)和丹毒絲菌屬(Erysipelatoclostridium)等。對照組與模型組在屬水平的構成上差異較大。

Fig 4 LEfSe hierarchical tree map of multistage species in faecesA: Cladogram; B: Biomarkers of different groups. Control group compared with hyperuricemia.

2.8 腸道菌群功能性預測采用PICRUSt(https://picrust.github.io/picrust/index.html)軟件分析不同分組之間的功能差異。預測準確性在腸道微生物菌群的功能分析接近95%，能非常好得反映樣品中的功能基因構成[8]。使用STAMP軟件中two groups的Welch’st-test方法，過濾去除P>0.05的部分，Heatmap plot、PCA plot和Extented error bar圖對不同樣本間的物種豐度進行顯著性差異兩兩檢驗。在糞便數據中發現多個相同功能預測結果(Fig 5)，其中氨基酸轉運與代謝(amino acid transport and metabolism)代謝途徑在兩組樣本中豐度較高，占主要地位，此外，二者還共同涉及糖轉運與代謝(carbohydrate transport and metabolism)、細胞壁/膜/包體生物合成(cellwall/membrane/envelope biogenesis)、翻譯及核糖體結構和生物合成 (translation, ribosomal structureand biogenesis)和轉錄(transcription)等代謝途徑(Fig 6)。

Fig 5 Metabolic function prediction of community samplesA: COG (Cluster of orthologous groups) heatmap; B: COG PCA plot.

Fig 6 Metabolic function prediction of community samplesA: KO (KEGG Ontology) nocorrection; B: KO PCA plot.

3 討論

隨著近年來我國經濟水平的高速發展，高尿酸血癥的發病率逐年增加，已成為僅次于糖尿病的第二大代謝疾病。相關研究顯示，UA可作為致炎、致氧化應激因子誘導認知功能障礙的發生，并可能最終導致一系列神經退行性疾病[3]。飲食是影響胃腸道微生物組成的重要因素，高糖、高脂、高嘌呤等所導致的高尿酸血癥模型中腸道菌群組成均發生變化[11]。腸道與大腦之間存在的腸道菌群-腸-腦軸，腸道菌群可能通過此軸調控宿主的腦功能和行為活動等[12]。因此，本研究采用16S rDNA測序技術分析大鼠糞便中腸道菌群多樣性，揭示高尿酸血癥輕度認知功能障礙模型大鼠腸道菌群結構發生改變，并檢測其學習與記憶功能。逃逸潛伏期和目標象限停留時間均為評價認知功能的重要指標。結果顯示模型大鼠的逃逸潛伏期相對空白對照組較長，且目標象限停留時間較短，表明其高尿酸血癥輕度認知功能障礙模型成功。

腸道菌群多樣性檢測結果表明，與對照組相比，模型大鼠糞便樣本中的菌群從門水平到屬水平均發生了顯著變化；糞便樣本腸道菌群雖構成相似，但不同門、屬之間的組成比例差異較大。糞便樣本中，厚壁菌門占據門水平中主要比例，軟壁菌門次之，其余還包括變形菌門；屬水平上，按所占比例依次為丁酸弧菌屬、瘤胃菌屬、厭氧原體屬、丹毒絲菌屬、丁酸球菌屬、Lachnoclostridium屬、Tyzzerella屬、副薩特氏菌屬和多爾氏菌屬等。其中，丁酸弧菌屬、丹毒絲菌屬、厭氧原體屬、Lachnoclostridium屬和多爾氏菌屬在高尿酸血癥大鼠糞便中豐度顯著升高，而瘤胃菌屬、丁酸球菌屬、Tyzzerella屬和副薩特氏菌屬豐度顯著降低。

在大鼠和人體內，厚壁菌門是腸道菌群門分類水平的主要組成部分。已有研究表明，肥胖、2型糖尿病和高尿酸血癥是導致認知衰退最常見的風險因素，高脂和高尿酸飲食被證明可以加速認知退化，且與厚壁菌門的比例相關，比例越高，癥狀越明顯[13]；亦有研究發現，其比值的升高與體內葡萄糖水平的惡化、脂肪積累的加重和體重的升高相關[14]。本實驗糞便樣本中，與空白組相比，模型組厚壁菌門豐度上升，如Butyrivibrio菌屬、Erysipelatoclostridium菌屬、Lachnoclostridium5菌屬和Dorea菌屬其比值呈上升趨勢。此結果與Sanguinetti等[14]的研究結果相符，表明Dorea菌屬與認知功能存在負相關關系。厚壁菌門還可參與調節免疫，從而進一步調節脂質、葡萄糖代謝和代謝綜合征。亦有研究表明高尿酸飲食導致脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)水平增加，產生內毒素血癥[15]。后者導致慢性低水平炎癥和氧化應激反應，這些都是代謝綜合征的特點。此外，LPS通過TLR信號通路直接維持炎癥，尤其是TLR4充當白細胞分化抗原CD14受體，介導LPS引起炎癥級聯和先天免疫反應[15]。上述改變均可導致中樞神經系統的慢性亞臨床炎癥以及氧化應激反應，最終可能導致出現認知及腦功能改變。

短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)是腸道微生物分解低聚糖、多糖、肽、蛋白質和糖蛋白產生的代謝產物，包括丁酸鹽、乙酸鹽及丙酸酯，不僅可以保持腸道的酸性環境，抑制腸道內有害菌的生長，還可以與GPR43受體結合刺激L細胞從而調節能量利用，與高尿酸血癥具有一定相關性[16]。研究表明，單鈉尿酸晶體(monosodium urate，MSU)可誘導白細胞趨化，進一步產生炎癥介質，從而導致痛風急性發作的炎癥反應。研究顯示，SCFAs在調節機體對MSU晶體導致的炎癥反應中發揮著重要作用[17]。另一項研究也表明，高尿酸血癥的發生機制與腸道菌群代謝產物LPS激活黃嘌呤氧化酶活性可能存在相關性。上述發現可以解釋本實驗中模型大鼠的糞便中與主要代謝物為丁酸鹽的丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)含量顯著升高的現象。

此外，本研究還在模型大鼠的糞便中發現變形菌門中副薩特氏菌屬(Parasutterella)含量顯著降低。前期研究已報道，副薩特氏菌屬(Parasutterella)能夠產生琥珀酸，可促進嚴格厭氧細菌的生長與繁殖，對宿主產生有益作用，且琥珀酸對機體有抗炎和抗氧化作用[18]。推測長期高尿酸飲食可能影響琥珀酸的生產，進而誘發輕度認知功能障礙。

越來越多的證據表明，腸道菌群失調涉及認知障礙過程，重新平衡腸道菌群可以緩解認知障礙和神經精神癥狀[11]。腦-腸軸通過腸道菌群及其代謝產物調節認知功能。大腦和腸道通過重疊和互補的信號通路，包括植物神經系統、神經內分泌和免疫系統，以及細菌代謝產物和神經調節分子完成互動對話[7]。來自中樞神經系統的許多神經纖維通過迷走神經終止于腸粘膜，并與脊髓的交感神經一起形成腸神經系統，從而調節腸的功能。同時，也可以使用來自腸的腸刺激。迷走神經的傳入纖維被上傳到中樞神經系統，以完成與大腦的信息交換。

綜上所述，以高尿酸血癥輕度認知功能障礙大鼠為實驗模型，采用16S rDNA測序技術分析大鼠糞便樣本中腸道菌群多樣性，研究長期高尿酸飲食對大鼠腸道菌群多樣性的干預作用，以期從腸道微環境的角度揭示高尿酸血癥誘發輕度認知功能障礙的作用機制，并為臨床開展合理防治措施提供參考依據。