活血解毒中藥配伍對缺氧/復氧誘導H9C2心肌細胞自噬損傷的保護機制

譚 令，付長庚，2，鄧 秘，曲 華，2，于子凱，2，黃明艷，龍霖梓

(1.中國中醫科學院西苑醫院，2.國家中醫心血管病臨床醫學研究中心,北京 100091)

近年研究表明，心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)，尤其是缺血性心臟病已發展為中國乃至世界范圍內發病率和致死率最高的疾病類型[1]，及時、有效的血液再灌注治療對于維持心臟功能和減少心肌損傷有重要作用。但在一定情況下，隨著血液灌流的恢復，心肌組織功能不僅不能恢復，反而造成更嚴重的心肌結構損傷和心肌功能障礙，這一病理過程稱為心肌的缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)。因此，探索MIRI的病理生理機制，并采取針對性的治療策略是臨床上亟需解決的難點之一。

自噬是一種進化保守的真核細胞內特有的溶酶體依賴性的胞內物質的分解代謝過程。在關于MIRI病理機制的探索過程中，已有研究發現心肌細胞自噬貫穿MIRI發生發展的全過程，甚至可誘發心肌細胞的凋亡及壞死，而PI3K/Akt/mTORC1 通路是對自噬起負調控作用的主要信號通路。自噬在MIRI不同時期發揮的作用是不同的，該通路主要通過調節mTOR的活性調控自噬活性：在心肌缺血階段，心肌組織因血液供應不足及ATP生成減少，致心肌mTOR的表達受到抑制，ULK1復合體被激活后轉移到內質網，進而誘導自噬泡膜形成，啟動自噬[2]。研究表明[3]，自噬對于維持心肌缺血損傷時的細胞環境穩態至關重要，因為此階段自噬水平輕度增強，自噬體可通過消化破損的線粒體等細胞器， 避免受損的線粒體釋放凋亡因子，保護心肌細胞免于死亡；而在再灌注階段，由于血液的重新供應，大量活性氧產生及Ca2+超載等原因引起Beclin-1 激活，進而導致心肌細胞自噬過度增強，加重心肌細胞的損傷，甚至出現細胞壞死，但此期心肌組織的血供被恢復后，血液中的生長因子、細胞因子和激素等成分可激活PI3K/Akt 信號通路，進而使其下游mTOR的抑制作用被解除，mTOR 激活后抑制再灌注期過度自噬的發生，從而保護心肌的缺血/再灌注損傷。

MIRI 據其臨床癥狀可歸屬中醫學“胸痹”、“真心痛”等范疇，《素問·脈要精微論》曰：“夫脈者，血之府也，長則氣治，短則氣病，……澀則心痛”，說明血脈瘀滯可致胸痹心痛，瘀血阻滯血脈，致氣、水、血運行不暢，繼而引起氣滯、痰飲、瘀血等實邪內停，久則蘊結為濁毒之邪，毒邪與瘀血、痰濁膠結，纏綿難解， 日久必郁而化火，邪熱易耗氣傷血，而心主血脈，故毒瘀最易損傷心臟而發胸痹、心痛之癥。臨證針對此類病機所致之胸痹，最當行活血解毒藥之法。

活血解毒中藥配伍由川芎、赤芍和黃連三藥組成，是課題組長期應用于臨床并獲得顯著效果的經驗方，既往藥理實驗研究表明，活血解毒中藥組分川芎嗪[4]、赤芍總苷[5]、黃連素[6]等均能有效改善MIRI，且不良反應較少，但尚未有研究證實上述活血、解毒中藥配伍應用對MIRI的治療機制，因此，本實驗決定在前期研究的基礎上，以缺氧/復氧H9C2心肌細胞模擬心肌缺血/再灌注損傷的體外模型，進一步探究活血解毒中藥對MIRI 的治療作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 H9C2細胞購自中橋新舟。

1.1.2藥物 活血解毒中藥由江陰天江藥業有限公司提供。

1.1.3主要試劑與儀器 氯喹(targetmol，T0194)、CCK8 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(Beyotime， C0037)、LC3(CST，12741)、β-catenin(affinity，AF6266)、Beclin-1(abcam， ab62557)、Bcl-2(abcam，ab196495)、磷酸酶抑制劑(碧云天，S1873)、PMSF(碧云天，ST506)、RIPA 裂解液(碧云天，P0013B)、BC 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，P0010)、蛋白marker(北京全式金生物技術有限公司，DM111)、顯影定影試劑盒(天津市漢中攝影材料廠)。

酶標儀(Thermo，MULTISKAN MK3)、垂直電泳槽(北京六一儀器廠， DYCZ-24DN)、電轉儀(北京六一儀器廠，DYCZ-40)、離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，HI650)、電泳儀電源(北京六一儀器廠，DYY-7C)。

1.2 方法

1.2.1缺氧/復氧損傷細胞模型的建立與分組 取對數生長期H9C2心肌細胞，用0.25%胰酶消化并收集細胞。以DMEM培養液(含10% FBS、100 kU·L-1青霉素和 100 kg·L-1鏈霉素)制成細胞懸液，以5×107個·L-1細胞密度接種于培養板中培養24 h。藥物處理24 h后，將心肌細胞置于1% O2、94% N2和5% CO2的低氧飽和濕度培養箱中孵育4 h，然后將細胞轉移至DMEM基礎培養基21%氧濃度的培養箱中繼續孵育6 h，制造H9C2心肌細胞缺氧/復氧模型。實驗共分為7組，正常對照組：H9C2心肌細胞在常規條件下培養；模型組：按上述方法制備缺氧/復氧損傷細胞模型；活血解毒中藥組：在缺氧/復氧損傷細胞模型基礎上加入適宜濃度的活血解毒中藥提取物；PI3K抑制劑LY294002組：在缺氧/復氧損傷細胞模型基礎上加入PI3K抑制劑LY294002；溶酶體抑制劑氯喹組：在缺氧/復氧損傷細胞模型基礎上加入溶酶體抑制劑氯喹； 活血解毒中藥聯合PI3K抑制劑LY294002組：在缺氧/復氧損傷細胞模型基礎上加入活血解毒中藥和LY294002；活血解毒中藥聯合溶酶體抑制劑氯喹組：在缺氧/復氧損傷細胞模型基礎上加入活血解毒中藥和氯喹。

1.2.2藥物配置 將川芎提取物：赤芍提取物：黃連提取物按1 ∶1 ∶1 配比，用PBS配制成一定濃度的母液，超聲溶解，高壓滅菌后于-20 ℃貯存備用。

1.2.3藥物適宜濃度的篩選 取對數生長期的H9C2細胞，以合適的細胞密度接種于培養板中培養24 h后，藥物處理24 h，將心肌細胞置于1% O2、94% N2和5% CO2的低氧飽和濕度培養箱中孵育4 h，然后將細胞轉移至DMEM基礎培養基21%氧濃度的培養箱中繼續孵育6 h，CCK8檢測細胞活性。

1.2.4細胞活性的檢測 取對數生長期的H9C2細胞，以5×107個·L-1細胞密度接種于培養板中培養24 h。藥物處理24 h后，將心肌細胞置于1% O2、94% N2和5% CO2的低氧飽和濕度培養箱中孵育4 h，然后將細胞轉移至DMEM基礎培養基21%氧濃度的培養箱中繼續孵育6 h。每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培養4 h，酶標儀測定各孔吸光值OD450。

1.2.5流式細胞術檢測 取處于對數生長期的H9C2細胞，調整細胞密度到5×108個·L-1，接入6孔板，每孔1 mL細胞懸液，37 ℃培養過夜；按分組處理后，收集細胞，按試劑盒說明依次加入Annexin V-FITC和PI室溫避光反應10 min；流式細胞儀上機檢測。

1.2.6激光共聚焦顯微鏡觀察 取對數生長期的H9C2心肌細胞，以合適的細胞密度接種于24孔培養板中，待細胞匯合度達到80%-90%時，將GFP標記的LC3質粒轉染至H9C2細胞中。培養24 h后按照分組處理，DAPI核染。將處理后的各組細胞于共聚焦顯微鏡下拍攝細胞自噬流。

1.2.7實時熒光定量 PCR 檢測 取對數生長期的H9C2心肌細胞，TRIzol 法提取總RNA，然后按逆轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄成cDNA，繼而以cDNA為模板進行PCR擴增，實時熒光定量PCR反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40循環。引物序列：LC3 Forward(CTTCTGAGCCAGCAGTAGGG LC3 Reverse(GAGGGACAACCCTAACACGA)、Beclin-1 Forward(AGGTTGAGAAAGGCGAGACA)、 Beclin-1 Reverse(AATTGTGAGGACACCCAAGC)、 Bcl-2 Forward(GAGGATTGTGGCCTTCTTTG)、Bcl-2 Reverse(ACAGTTCCACAAAGGCATCC)、 β-actin Forward(CTCCATCCTGGCCTCGCTGT)、 β-actin Reverse(GCTGTCACCTTCACCGTTCC)。

1.2.8Western blot檢測 細胞培養同“1.2.1”。加入裂解液于冰上裂解細胞30 min，繼而低溫離心后取上清分裝。用BCA試劑盒進行蛋白定量。將蛋白變性完后冷卻至室溫。然后依次進行凝膠電泳、轉膜、封閉和一抗、二抗孵育。二抗孵育結束后，TBST洗滌3次，最后加入ECL化學發光液在成像系統中進行掃描。

2 結果

2.1 給藥濃度的確定如Fig 1，中藥提取混合物的IC50為5.067 g·L-1；濃度低于0.05 g·L-1時對細胞增殖的影響不明顯，而高于0.15 g·L-1時又會對細胞造成損傷。因此，0.15 g·L-1濃度的中藥提取液既有利于心肌細胞的增殖，又能很大程度地緩解缺氧/復氧帶來的自噬損傷，所以選擇此藥物濃度進行后續的自噬機制研究。

Fig 1 Screening of mixed Chinese medicine extract concentration

2.2 各組細胞生長活性的比較如Fig 2，H9C2 細胞經缺氧/復氧處理后，細胞生長活性降低。與缺氧/復氧處理組相比，經活血解毒中藥和溶酶體抑制劑氯喹預處理后，細胞生長活性增加；經PI3K抑制劑LY294002處理后，細胞生長活性進一步降低；活血解毒中藥和LY294002聯合預處理后，細胞生長活性高于單獨LY294002處理，但低于單獨活血解毒中藥處理?；钛舛局兴幒吐揉摵项A處理后，細胞生長活性高于單獨活血解毒中藥處理或單獨氯喹處理。結果提示，缺氧/復氧能降低細胞生長活性，且與PI3K通路密切相關。

Fig 2 Detection of cell growth activity

2.3 活血解毒中藥對缺氧/復氧 H9C2心肌細胞凋亡率的影響如Fig 3，H9C2細胞經缺氧/復氧處理后，細胞凋亡率增加。與缺氧/復氧處理組相比，經活血解毒中藥和氯喹預處理后，細胞凋亡率顯著降低；經LY294002預處理后，細胞凋亡率進一步增加；活血解毒中藥和LY294002聯合預處理后，細胞凋亡率低于單獨LY294002處理，但高于單獨活血解毒中藥處理?；钛舛局兴幒吐揉摵项A處理后，細胞凋亡率低于單獨活血解毒中藥處理或單獨氯喹處理。

Fig 3 Detection of apoptotic rate

2.4 活血解毒中藥對缺氧/復氧 H9C2心肌細胞自噬水平的影響如Fig 4，H9C2細胞經過缺氧/復氧處理后，細胞綠色點狀聚集物明顯增多，自噬水平增加。與缺氧/復氧處理組相比，經活血解毒中藥和氯喹預處理后，細胞綠色點狀聚集物明顯減少，自噬水平降低；經LY294002預處理后，細胞綠色點狀聚集物進一步增多，自噬水平進一步增加；活血解毒中藥和LY294002聯合預處理后，細胞綠色點狀聚集物少于單獨LY294002處理，但多于單獨活血解毒中藥處理?；钛舛局兴幒吐揉摵项A處理后，細胞綠色點狀聚集物少于單獨活血解毒中藥處理或單獨氯喹處理。

Fig 4 Autophagy protein LC3 observed by fluorescence microscopy, with a scale of 25 μm

2.5 活血解毒中藥對缺氧/復氧H9C2心肌細胞內Beclin-1、LC3和Bcl-2 mRNA水平的影響如Fig 5，H9C2細胞經過缺氧/復氧處理后，Beclin-1和LC3 mRNA 表達顯著增加，Bcl-2 mRNA表達顯著降低，說明缺氧/復氧能夠引起自噬水平增加，且能促進細胞凋亡。與缺氧/復氧處理組相比，經過活血解毒中藥和氯喹預處理后，Beclin-1和LC3 mRNA表達顯著降低，而Bcl-2 mRNA 表達升高；經LY294002預處理后，Beclin-1和LC3 mRNA 表達升高，而Bcl-2 mRNA 表達明顯降低；經活血解毒中藥和LY294002聯合預處理后，Beclin-1和LC3 mRNA表達水平較LY294002單獨處理降低，但較單獨活血解毒中藥處理升高，而Bcl-2 mRNA表達較LY294002單獨處理明顯升高，較單獨活血解毒中藥處理明顯降低；經活血解毒中藥和氯喹聯合預處理后，Beclin-1和LC3 mRNA表達水平較單獨氯喹或活血解毒中藥處理均降低，而Bcl-2 mRNA表達較單獨氯喹或活血解毒中藥處理均升高。

Fig 5 mRNA expression in cells

2.6 活血解毒中藥對缺氧/復氧H9C2心肌細胞內自噬及凋亡相關蛋白表達的影響如Fig 6，H9C2細胞經過缺氧/復氧處理后，自噬相關蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達增加，p62、p-AKT、p-mTOR表達降低，PI3K/Akt/mTORC1通路活化減弱，自噬增強；凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3、β-catenin、p-p65表達增加，Bcl-2表達降低，凋亡增加。與缺氧/復氧處理組相比，經過活血解毒中藥和氯喹預處理后，Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達減少，p62、p-AKT、p-mTOR表達增加，PI3K/Akt/mTORC1 通路活化增強，Cleaved caspase-3、β-catenin、p-p65表達降低；經過LY294002預處理后，Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達增加，p62、p-AKT、p-mTOR和Bcl-2表達降低；Cleaved caspase-3、β-catenin、p-p65表達增加；活血解毒中藥和LY294002聯合預處理后，Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Cleaved caspase-3、β-catenin、p-p65等蛋白表達水平較單獨LY294002處理升高，但其較單獨活血解毒中藥處理降低，p62、p-AKT、p-mTOR 的表達則相反；活血解毒中藥和氯喹聯合預處理后，Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Cleaved caspase-3、β-catenin、p-p65 等蛋白表達水平較單獨氯喹或活血解毒中藥處理升高，p62、p-AKT、p-mTOR 的表達水平則較單獨氯喹或活血解毒中藥處理降低。

Fig 6 Protein expression in cells

3 討論

心肌缺血/再灌注損傷(MIRI)是一系列心血管疾病發生的重要病因[7]。目前，對于缺血性心臟病，現代醫學采用的經皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈旁路移植術等雖可顯著改善患者心肌缺血的癥狀和預后，但由于MIRI的存在，心肌缺血經治療后一年內仍有較高的心力衰竭發生率[8]。

本實驗研究發現H9C2心肌細胞在缺氧/復氧誘導下，細胞生長活性降低，凋亡率增加，在激光共聚焦顯微鏡下可見細胞內自噬體結構顯著增加，表明體外MIRI 模型建立成功。且本研究與屈玉春等[9]研究結果一致，表明缺血處理可誘導體外培養的心肌細胞凋亡，同時激活自噬，而再灌注處理使得自噬被過度激活， 則加速心肌細胞死亡。

心肌缺血期，心肌細胞由于缺乏能量供應而發生大量壞死和凋亡。caspase-3是細胞凋亡的關鍵起始基因，caspase-3 通過自身的寡聚化活化為凋亡的主要執行者Cleaved caspase-3，其通過激活下游多種蛋白酶而執行細胞凋亡。因此，caspase-3的激活標志著細胞凋亡開始執行且不可逆轉[10]。p65是構成核轉錄因子NF-κB 異源二聚體的亞基之一，當p65被磷酸化激活后，可通過上調下游靶基因的表達，啟動細胞凋亡的級聯反應，誘導細胞凋亡[11]。此外，在心肌缺血期，因能量危機致心肌細胞大量凋亡的同時，還伴有自噬的輕度激活。此期自噬的發生可消化受損的線粒體，并產生新的能量和原料，使缺血損傷的心肌獲得修復，且能有效抑制心肌細胞凋亡，顯著降低心肌細胞的凋亡率[12]。因此，MIRI的心肌缺血期主要表現為心肌細胞凋亡和自噬激活介導對心肌的保護。

再灌注時期，心肌細胞由于恢復了能量供應，產生大量氧自由基產生，引起自噬的異常過度激活。有研究表明，在再灌注過程中，自噬加速可引起心肌細胞損傷，進而促進細胞死亡[13]。Beclin-1與Bcl-2是調控自噬的關鍵蛋白，且Bcl-2是自噬和凋亡的中央調控因子[14]。此兩者的平衡狀態是調控自噬與凋亡相互反饋作用的關鍵因素，在再灌注過程中，Beclin-1的表達量明顯增多，致Bcl-2與Beclin-1表達失衡，則Bcl-2表達的相對下調既可誘發凋亡加重，又可通過激動Beclin-1來激活自噬，加速心肌細胞死亡[15]。因此，MIRI 的再灌注期主要表現為心肌自噬的過度激活及其引起的細胞凋亡加重。

參與再灌注過程中的自噬相關蛋白還包括 LC3 和 p62 等。其中 LC3 主要介導自噬體的成熟：LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例越高說明自噬活性越強，因此 LC3 可用于相對定量地評價自噬體的活性程度[16]。p62則參與自噬的降解，通過與LC3蛋白結合形成復合物，并將LC3與待降解泛素化生成物連接，最終于溶酶體內進行降解，因此，p62可隨著自噬作用的進行而不斷被消耗[17]。

本研究采用了氯喹干預作為對照組，因氯喹具有溶酶體趨向性，能選擇性地進入溶酶體內，破壞溶酶體的酸性環境，使溶酶體不能降解自噬體包裹的受損蛋白質和細胞器等物質，從而抑制細胞自噬過程。研究結果顯示氯喹干預組的自噬和凋亡水平較模型組降低，同時，聯合運用活血解毒中藥與氯喹干預也導致心肌細胞的自噬和凋亡水平較單獨運用活血解毒中藥組或單獨運用氯喹組更低，說明活血解毒中藥能有效抑制心肌細胞的自噬和凋亡。且研究檢測發現，H9C2細胞經缺氧/復氧處理后，Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Cleaved caspase-3、β-catenin 和p-p65等介導自噬或凋亡的蛋白表達增加，而Bcl-2、p62、p-AKT和p-mTOR等抑制自噬或凋亡的蛋白表達降低，活血解毒中藥預處理可有效逆轉上述蛋白表達，再次證明活血解毒中藥能抑制MIRI過程中自噬和凋亡的發生。

為進一步明確活血解毒中藥抑制缺氧/復氧心肌自噬和凋亡的分子信號通路機制。本實驗設置了PI3K特異性抑制劑LY294002干預組作為對照組[18]，從而使PI3K/Akt/mTORC1通路被抑制。研究發現單獨用LY294002處理缺氧/復氧的H9C2細胞可導致其自噬和凋亡水平升高，而聯合運用活血解毒中藥與LY294002 預處理后，心肌細胞的自噬和凋亡水平較單獨LY294002處理降低，但較單獨活血解毒中藥處理升高，說明活血解毒中藥可能是通過調控PI3K信號通路降低心肌細胞的自噬和凋亡水平，從而有效保護心肌細胞的缺血/再灌注損傷。

綜上所述，活血解毒中藥配伍可通過調控PI3K/Akt/mTORC1自噬通路，降低心肌細胞自噬和凋亡水平，從而對缺氧/復氧損傷H9C2心肌細胞起到保護作用。本研究證實了活血解毒中藥可有效保護缺氧/復氧誘導的H9C2心肌細胞損傷，為臨床合理治療心肌缺血/再灌注損傷開辟了思路。