木耳菌糠半纖維素水解制備還原糖

于夢堯，鄭喜群，劉曉蘭，王艷菊，甄珍，錢朋智

1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院（齊齊哈爾 161006）；2.黑龍江八一農墾大學食品學院（大慶 163711）；3.黑龍江省哈爾濱海關技術中心齊齊哈爾綜合實驗室（齊齊哈爾 161000）

中國是食用菌生產、消費大國，生產食用菌的同時會產生大量培養基廢料（菌糠），對食用菌的持續發展帶來挑戰[1]。因此，合理處理食用菌菌糠，實現廢物再利用、變廢為寶成為研究熱點。研究發現，食用菌菌糠中含有多種水溶性養分和豐富的有機物質，根據基質的不同，粗纖維占10%～30%，粗蛋白占5%～15%，且含有一定量的微量元素[3-6]。食用菌菌糠的資源化利用受到廣泛關注，已報道的利用途徑有10余種[7]，多集中于動物飼料[8]、食用菌的二次栽培[9-10]、改良土壤[11]、能源材料[12]等方面。

半纖維素是自然界中最豐富的可再生生物資源之一[13]，是一類復合聚糖的總稱，主要是由木糖、阿拉伯糖和葡萄糖等多種還原糖構成的功能性聚糖[14]。相關研究表明，木糖和阿拉伯糖等作為功能性還原糖，具有獨特的生理功能，在食品、飼料和醫藥方面具有廣泛的用途[15-16]，在營養與保健、畜牧養殖、植物生長調節及抗病害等方面具有極大的潛力[17]。菌糠半纖維素的功能性還原糖開發是探索菌糠合理利用的途徑之一[18]。但是關于菌糠功能性還原糖研究的相關報道較少，若能合理分析、研究和利用這些半纖維素，不僅可以實現廢物的循環利用，減少環境污染，同時還可增加經濟效益，具有重要的研究價值。

以木耳菌糠為原料，采用高溫蒸煮對其進行預處理，優化預處理條件，以達到去除雜質的目的；以低濃度稀酸溶液作為催化介質，研究木耳菌糠半纖維素的降解技術，優化水解條件，獲得半纖維素還原糖；應用D301弱陰離子交換層析、001×7強陽離子交換層析聯合D201強陰離子交換層析對所得半纖維素還原糖進行分離純化，采用高效液相色譜（HPLC）對半纖維素還原糖組成進行測定，以期為食用菌菌糠半纖維素還原糖結構解析及功能性產品的研究開發提供初步理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

木耳菌糠，齊齊哈爾大學食品與生物工程學院微生物培養室提供，粉碎后過0.425 mm（40目）孔徑篩，取篩下物，備用；D301弱陰離子交換樹脂、001×7強陽離子交換樹脂及D201強陰離子交換樹脂（浙江爭光實業股份有限公司）；3種單糖標準品：D（+）-葡萄糖（glucose，Glu）、D（+）-木糖（xylose，Xyl）、L-阿拉伯糖（arabinose，Ara），山東龍力生物科技股份有限公司；氫氧化鈉、四水酒石酸鉀鈉、硫酸銅、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、濃鹽酸等（均為國產分析純）；濃硫酸（國產色譜純）。

1.2 主要儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械有限公司）；布氏漏斗裝置（蜀牛玻璃儀器有限公司）；手持折光計（成都泰華光學有限公司）；有機玻璃離子交換柱（江蘇金三陽水處理科技江蘇有限公司）；BIO RAD Aminex HPX-87H色譜柱（美國伯樂公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝總路線

木耳菌糠→粉碎至0.425 mm（40目）→高溫預處理→低濃度稀硫酸溶液水解→離子交換樹脂分離純化→高效液相色譜色譜分析單糖組成

1.3.2 木耳菌糠高溫預處理條件單因素試驗

以蒸煮溫度（108，113，118，123和128 ℃）、蒸煮時間（15，30，60，90和120 min）、固液比（1∶5，1∶8，1∶10，1∶15和1∶20 g/mL）為單因素，以雜質去除率和總還原糖損失率為指標，篩選木耳菌糠最佳預處理條件。每個處理稱取50 g木耳菌糠（干基）。

1.3.3 木耳菌糠水解條件單因素試驗

取等量預處理后的物料，以固液比（1∶5，1∶8，1∶10，1∶15和1∶20 g/mL）、硫酸濃度（0.5%，1.0%，1.2%，1.5%和2.0%）、水解溫度（108，113，118，123和128 ℃）、水解時間（60，90，120，150和180 min）為單因素，以還原糖得率為指標，選出最佳木耳菌糠水解條件。每個處理稱取50 g木耳菌糠（干基）。

1.3.4 木耳菌糠半纖維素還原糖的分離純化

還原糖的分離純化方法參考張梅娟等[19]的方法。

1.3.5 木耳菌糠半纖維素還原糖的單糖組成分析

14種單糖標準液配制：配制質量濃度1%的蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、甘露糖醇、阿拉伯醇、半乳糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇和山梨醇，均置于4 ℃冰箱中備用，進色譜柱之前用0.22 μm膜、超聲波脫氣處理。待測樣品的前處理及色譜條件參考張梅娟等[19]的方法。

1.3.6 木耳菌糠半纖維素還原糖相關指標測定

雜質去除率和總還原糖損失率的測定、總還原糖含量的測定、糖液總還原糖得率的測定、糖液純度計算和電導率的測定方法參考張梅娟等[19]的方法。

2 結果與分析

2.1 木耳菌糠預處理條件的研究

2.1.1 最佳蒸煮時間的選擇

預處理的目的是盡可能除去水解原料內部雜質，如果膠、脂肪、含氮物、灰分和色素等，同時盡可能減少還原物的損失，一般要求預處理后的還原物損失率不超過2%[20]。

由表1可知：隨著蒸煮時間延長，木耳菌糠雜質去除率逐漸升高，在120 min時可達23.27%，效果較好，但總還原糖的損失率也隨之增加。為使總還原糖損失不超過2%，從木耳菌糠雜質去除率和總還原糖損失率綜合考慮，最佳蒸煮時間選擇30 min，此條件下總還原糖損失率為1.66%，雜質去除率為18.15%。

表1 不同蒸煮時間對木耳菌糠預處理的影響

2.1.2 最佳蒸煮溫度的選擇

溫度不僅會影響雜質的去除，而且會導致還原物的損失。由表2可知：隨著蒸煮溫度升高，木耳菌糠的雜質去除率逐漸增加，在128 ℃時可達30.44%。溫度123 ℃時總還原糖損失率最高，為1.45%，溫度繼續增加，損失率開始降低，原因可能是蒸煮溫度過高，溶出的還原糖發生了副反應，轉化成其他物質。從木耳菌糠總還原糖雜質去除率和損失率綜合考慮，最佳蒸煮溫度選擇123 ℃，此條件下總還原糖損失率為1.45%，雜質去除率為23.11%。

表2 不同蒸煮溫度對木耳菌糠預處理的影響

2.1.3 最佳預處理固液比的選擇

從表3可看出：不同固液比對木耳菌糠雜質去除率和總還原糖損失率的影響不同。固液比1∶20（g/mL）時，雜質去除率最高，可達39.34%。隨著固液比的增加，總還原糖損失率先升高后降低，可能是溶出的還原糖轉化為其他物質。雖然固液比1∶20（g/mL）時的雜質去除率比固液比1∶8（g/mL）時雜質去除率高，但相應的還原糖損失率也高，因此，從木耳菌糠總還原糖損失率和雜質去除率、生產成本、能耗等多方面綜合考慮，選擇1∶8（g/mL）為最佳固液比。

表3 不同固液比對木耳菌糠預處理的影響

結果表明，木耳菌糠最佳預處理條件為蒸煮溫度123 ℃、蒸煮時間30 min、固液比1∶8（g/mL）。

2.2 木耳菌糠水解條件的研究

2.2.1 固液比對木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

由圖1可知：固液比對木耳菌糠水解液還原糖的得率有一定程度的影響。還原糖得率隨著固液比的增加而升高，達到最大值后隨著固液比的增加又逐漸降低。固液比1∶8（g/mL）時，得率最高，可達13.98%，與其他固液比相比，差異顯著。這說明在低固液比（1∶5和1∶8 g/mL）時，水解反應速度增加較快，但固液比達到一定程度時，反應速度開始緩慢。因此，從生產成本等多方面考慮，最佳固液比選擇1∶8（g/mL）。

圖1 固液比對木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

2.2.2 硫酸濃度對木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

由圖2可知：木耳菌糠水解液還原糖得率隨著溶液中硫酸濃度增大呈現先升高后降低趨勢。硫酸濃度1.2%時，水解液還原糖得率最高，為14.51%；硫酸濃度大于1.2%時，還原糖得率降低。易守連等[21]在研究玉米芯纖維素、半纖維素分離及水解成可發酵性糖時發現，酸濃度增大會導致纖維素碳化。試驗中硫酸濃度過高時還原糖得率降低，分析原因是硫酸濃度過高導致半纖維素被碳化。因此，最佳硫酸濃度選擇1.2%。

圖2 硫酸濃度對木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

2.2.3 溫度對木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

溫度是影響水解的主要條件因素之一。由圖3可知：溫度對木耳菌糠水解液還原糖得率的影響較大。隨著溫度升高，還原糖得率呈現波動趨勢。在123 ℃時達到最大值，為13.86%。在較高溫度（128 ℃）下還原糖發生降解，得率下降。因此選取123 ℃作為最佳溫度。

圖3 溫度對木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

2.2.4 時間對木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

在保證水解效果的同時縮短水解時間可以提高還原糖的生產效率。由圖4可以看出：水解時間低于90 min時，還原糖得率較低，均低于10%；隨著水解時間延長，還原糖得率增加迅速，在150 min時達到最大值，為14.31%，說明隨著時間延長，木耳菌糠中的半纖維素得到充分水解。水解時間繼續延長，還原糖得率顯著下降，這可能是因為過長的水解時間引起副反應的發生，導致非糖物質增加，所以最佳水解時間選擇150 min。

圖4 時間對木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

結果表明，木耳菌糠最佳水解條件為固液比1∶8（g/mL）、硫酸濃度1.2%、水解溫度123 ℃、水解時間150 min。

2.3 分離純化

由表4可知：木耳菌糠半纖維素水解液經D301離子交換層析后，電導率有一定程度的降低，水解糖純度進一步升高，總還原糖損失率為2.55%；D301離子交換層析收集的糖液經001×7離子交換層析后，電導率持續降低，水解糖純度再一次升高，總還原糖的損失率為2.71%；001×7離子交換層析收集的糖液經D201離子交換層析后，水解糖純度持續升高，總還原糖損失率為2.64%，從D201離子交換層次收集的糖液電導率為95 μS/cm，純度為88.74%。

表4 木耳菌糠半纖維素水解糖純化結果

2.4 木耳菌糠半纖維素還原糖的單糖組分分析

糖類分析的主要目的是單糖、寡糖的組成和多糖的分子量及其分布。糖類物質的分離可以通過HPLC在色譜柱中實現。采用BIO RAD Aminex HPX-87H高效液相色譜法可確定14種單糖標準品的出峰時間，結果如表5所示。

表5 14種單糖標準品的出峰時間

采用BIO RAD Aminex HPX-87H高效液相色譜法對木耳菌糠半纖維素還原糖的單糖組成進行分析，結果如圖5所示。

由圖5可知：木耳菌糠半纖維素水解糖高效液相色譜圖中出現3個主峰，保留時間與前期預試驗中蔗糖、乳糖、甘露糖、半乳糖、果糖、半乳糖醇、甘露糖醇、山梨醇、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇等11種標準品的保留時間不同，而與D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖標準品出峰保留時間一致，表明木耳菌糠半纖維素水解液還原糖主要由D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖組成，其中D-木糖含量最高，各單糖物質的量比為1.00∶4.68∶0.85。

圖5 木耳菌糠半纖維素還原糖高效液相色譜圖

3 結論

通過單因素五水平試驗，得出木耳菌糠制備半纖維素還原糖的最優預處理條件：蒸煮溫度123 ℃、蒸煮時間30 min、固液比1∶8（g/mL）。通過單因素五水平試驗，木耳菌糠最佳水解條件為水解固液比1∶8（g/mL）、硫酸濃度1.2%、水解溫度123 ℃、水解時間150 min。

木耳菌糠半纖維素水解液采用D301弱陰離子交換層析、001×7強陽離子交換層析及D201強陰離子交換層析的方法可起到很好的分離純化效果。采用HPLC對木耳菌糠半纖維素水解糖進行分析，通過與單糖標準品出峰時間進行對比分析，確定木耳菌糠半纖維素還原糖是由D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖3種單糖按照不同比例縮合而成的，各單糖物質的量比為1.00∶4.68∶0.85。

國內外針對食用菌菌糠半纖維素的研究較少，若能合理分析、研究和利用這些半纖維素，不僅可以實現廢物的循環利用，減少環境污染，同時還可以增加經濟效益，值得進一步研究。試驗對木耳菌糠的預處理、半纖維素的水解、水解液的分離純化、還原糖的單糖組成等進行研究，以期為食用菌菌糠半纖維素還原糖結構解析及功能性產品的研究開發提供初步理論依據。