高活性納豆固態發酵工藝優化及納豆口含片制備

王晶，劉鵬莉

煙臺職業學院（煙臺 264670）

納豆是在熟大豆中接種枯草芽孢桿菌或者納豆菌發酵制成的產品，具有一定的保健功效[1]。納豆源于中國，在奈良、平安時代由禪僧傳入日本。古書《和漢三才圖會》記載：納豆自中國秦漢以來開始制作。最初生產納豆是利用稻草上的芽孢桿菌進行發酵，在寺廟的廚房制造，因為寺廟的廚房叫“納所”，所以稱為納豆。

新鮮發酵的納豆具有金黃色的色澤，口感酥軟，表面布滿黏稠的液體。每百克納豆中含31.2 g蛋白質、19.9 g脂肪、22.8 g碳水化合物、331 mg鈣、13.7 mg鐵[2]。大量研究結果表明，納豆不但能夠有效預防和治療心腦血管疾病[3-4]，還具有保肝護肝、抗腫瘤、抗氧化以及延緩衰老等多種功效[5-7]。納豆的保健功能主要與其中的納豆激酶有關。納豆激酶是納豆在發酵過程中由菌體產生一種絲氨酸蛋白酶，1987年日本須見洋行首次發現該酶[8]。納豆中含有的納豆激酶具有很好的溶栓效果[9-10]，經常食用納豆可有效地預防心腦血管疾病的發生。納豆的保健功能與納豆激酶的活性密切相關，通過優化發酵工藝提高納豆激酶活性可有效增強納豆的保健功能。

北京、天津等較大城市的少數企業已開始生產納豆，人們也開始慢慢了解納豆的營養功效并嘗試食用。但是仍有許多消費者不愿意接受市售納豆的特殊味道。試驗從日本納豆中分離到的高活性納豆激酶菌種，采用單因素試驗和正交試驗優化納豆固體發酵工藝，制備具有高活性的納豆，并采用冷凍升華干燥技術，粉碎后設計產品的配方，壓制成片。這種功能性產品適合大多數人的口味，能夠長期保存，市場前景良好，可帶來良好社會效益和經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆桿菌（實驗室儲藏）；優質大豆（煙臺）；N-對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（TAME，分析純，上海藍季科技發展有限公司）；瓊脂粉（生化試劑，天津市北辰方正試劑廠）。

固體培養基：牛肉浸膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂5 g/L，pH 7.2～7.4，0.1 MPa、121 ℃滅菌20 min。

液體培養基：葡萄糖10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 3 g/L，pH 7.2～7.4，0.1 MPa、121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

YXQG02手提式電熱壓力蒸汽消毒器（山東新華安得醫療用品有限公司）；TU-1810紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；SW-CJ-2G雙人凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；SCIENTZ-10N冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DC140實驗型單沖頭壓片機（上海達程實驗設備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化[11]

將納豆桿菌接種到平板培養基上，在37 ℃恒溫培養24 h。用接種環從平板上挑取一環菌體接入裝有液體培養基的錐形瓶中，在37 ℃搖床振蕩培養36 h。

1.3.2 納豆激酶活性測定

采用TAME法[12]測定納豆激酶活性。將0.1 mol/L TAME溶液、磷酸鹽緩沖液和樣品溶液各0.1 mL混合均勻，在37 ℃水浴加熱30 min。加入0.2 mL 15%三氯乙酸，混勻，依次加入0.1 mL 2%高錳酸鉀溶液和0.1 mL 10%亞硫酸鈉溶液，混合均勻。加入4.0 mL變色酸溶液，沸水浴加熱25 min，冷卻至室溫，測定574 nm處吸光度。以去離子水代替樣品溶液作為空白對照。

1.3.3 固態發酵制備納豆

選用顆粒飽滿、大小均勻、色澤黃亮、豆皮完整、無龜裂破損、無蟲眼、無霉變的大豆為原料，剔除異物、沙土等雜質，用蒸餾水沖洗干凈，在20 ℃下浸泡12 h，瀝干水分。將浸泡好的大豆放入電熱壓力蒸汽消毒器中，于121 ℃、0.1 MPa加熱10 min，冷卻至室溫。將蒸煮好的大豆放在超凈工作臺中紫外照射滅菌20 min，接入納豆菌液。將接種好的大豆放于37℃恒溫培養箱中恒溫培養24 h。發酵結束后，取出納豆，冷卻至室溫，置于冰箱中4 ℃后熟24 h。

1.3.4 納豆口含片制備

將后熟好的納豆取出，于-51 ℃預凍30 min，然后冷凍干燥。將凍干后的納豆放入粉碎機中粉碎，將納豆磨成粉末。制成的納豆粉末具有濃烈的臭味，向納豆粉末中添加葡萄糖、食鹽、環狀糊精、卡拉膠等添加劑對臭味進行掩蓋。將混合后的粉末放入壓片機中，壓制成片。

1.3.5 納豆口含片感官評價

選擇10人組成感官評價小組，對納豆口含片的風味進行評定。感官評價標準如表1所示。

表1 納豆口含片感官評價標準

1.3.6 納豆固態發酵條件優化

1.3.6.1 單因素試驗

采用單因素試驗考察大豆浸泡pH、大豆含水量、接種量、物料厚度和碳源種類對發酵納豆中納豆激酶活性的影響。各因素水平設定情況如表2所示。各因素固定水平為大豆浸泡pH 6、大豆含水量65%、接種量9%、物料厚度2 cm、無碳源。

表2 固態發酵單因素試驗因素與水平

1.3.6.2 正交優化試驗

在單因素試驗基礎上，分析選取對納豆激酶活性影響顯著的大豆浸泡pH（A）、接種量（B）、物料厚度（C）和碳源種類（D）4個因素，進行L9(34)正交試驗，以納豆激酶活性作為評定指標，對納豆固態發酵工藝進行優化。正交試驗的因素水平設定情況如表3所示。

表3 固態發酵正交試驗因素與水平

1.3.7 納豆口含片配方優化

1.3.7.1 單因素試驗

采用單因素試驗考察葡萄糖、食鹽、環狀糊精和卡拉膠的添加量對納豆口含片感官品質的影響。單因素試驗因素與水平如表4所示。

表4 納豆口含片單因素試驗因素與水平 單位：%

1.3.7.2 響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，以納豆口含片感官評價得分作為響應值，以葡萄糖添加量（A）、食鹽添加量（B）、環狀糊精添加量（C）和卡拉膠添加量（D）作為因素進行正交試驗，對納豆口含片配方進行優化。正交試驗的因素水平設定情況如表5所示。

表5 納豆口含片響應面試驗因素與水平 單位：%

1.4 數據統計

采用Excel 2018進行數據統計，數據均通過3次獨立試驗獲得。

2 結果與分析

2.1 納豆固態發酵單因素試驗結果

2.1.1 大豆浸泡pH對納豆激酶活性的影響

大豆初始pH直接影響細胞的代謝活動，還影響大豆中營養物質的離子化程度，從而間接影響納豆菌對營養物質的利用，對納豆激酶產量及活性造成影響[11]。如圖1所示：在弱酸性條件下浸泡大豆，發酵所得納豆激酶活性較高，大豆浸泡pH 6時，發酵獲得的納豆具有最高活性。隨著pH升高，納豆激酶活性呈波浪狀下降趨勢。大豆浸泡pH 7時，發酵所得納豆激酶活性最低。

圖1 浸泡pH對納豆激酶活性的影響

2.1.2 大豆含水量對納豆激酶活性的影響

如圖2所示：納豆激酶活性隨大豆含水量增加而增加，含水量超過55%時，納豆激酶活性隨含水量增大趨勢變緩。含水量影響納豆菌的生長狀態從而影響產酶量[13]。含水量過低時，納豆菌生長受到限制。

圖2 含水量對納豆激酶活性的影響

2.1.3 接種量對納豆激酶活性的影響

如圖3所示：納豆激酶活性隨接種量增加先降低后升高。接種量3%時，產品納豆激酶活性具有最大值，接種量9%時，納豆激酶活性最低。此結果與田莉等[14]的研究結果相似。當接種量少時，營養物質充足，菌體生長及產酶均不受限制，產酶量高[15]。接菌量過高時，可能造成前期菌體生長過快，消耗的基質較多，相應地產酶所需的養分就少，產酶量下降，并且菌體之間存在競爭。接種量超過9%后，隨著接種量增加，雖然單個菌體的產酶量下降，但菌體總數在增加，從而產酶總量增加，但會造成菌體浪費。

圖3 接種量對納豆激酶活性的影響

2.1.4 物料厚度對納豆激酶活性的影響

由圖4可知：納豆激酶活性隨物料厚度先減小后增加。物料厚度1 cm時，發酵所得納豆中納豆激酶活性最高，物料厚度3 cm時，納豆激酶活性最低。發酵厚度增加造成氧氣供應受阻，因而影響納豆菌的生長。物料厚度超過3 cm時，繼續增大物料厚度，物料總量增加，接種的菌體總量也隨之增加，雖然單個菌體產酶量降低，但接入菌體的產酶總量增加。

圖4 物料厚度對納豆激酶活性的影響

2.1.5 碳源種類對納豆激酶活性的影響

由圖5可知：以甘油作為碳源，發酵所得納豆激酶活性最高；以木糖、蔗糖為碳源，納豆激酶活性與空白組無顯著差別；添加麥芽糖為碳源，納豆激酶活性降低，說明麥芽糖不利于納豆發酵產酶。該結果與郭海勇等[16]研究結果存在差異。郭海勇等研究表明，麥芽糖為最佳碳源，添加甘油、木糖后，產酶活力下降。這種差異可能與試驗菌種不同有關。

圖5 碳源種類對納豆激酶活性的影響

2.2 納豆固態發酵正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選取浸泡pH（A）、接種量（B）、物料厚度（C）、碳源種類（D）4個因素進行正交試驗，以納豆激酶活性作為評價指標對發酵條件進行優化。正交試驗因素結果見表6。

由表6可知，4個因素對納豆激活活性的影響程度為碳源＞接種量＞pH＞物料厚度，即碳源種類的影響最大。納豆固態發酵條件最優組合為D1B2A1C3，即碳源采用甘油，接種量6%，pH 5，物料厚度3 cm。

表6 納豆固態發酵響應面試驗結果

2.3 納豆含片單因素試驗

2.3.1 葡萄糖添加量的確定

取5份納豆凍干粉，分別向其中加入納豆粉末質量2.0%，4.0%，6.0%，8.0%和10.0%的葡萄糖，混合均勻。按照表1的感官評價標準進行評分，結果見表7。

表7 葡萄糖添加量對納豆粉末口味的影響

2.3.2 食鹽添加量的確定

取5份納豆凍干粉，分別向其中加入納豆粉末質量2.0%，4.0%，6.0%，8.0%和10.0%食鹽，混合均勻。按照表1的感官評價標準進行評分，結果見表8。

表8 食鹽添加量對納豆粉末口味的影響

2.3.3 環狀糊精添加量的確定

取5份納豆凍干粉，分別向其中加入納豆粉末質量2.0%，4.0%，6.0%，8.0%和10.0%的環狀糊精，混合均勻。按照表1的感官評價標準進行評分，結果見表9。

表9 環狀糊精添加量對納豆粉末口味的影響

2.3.4 卡拉膠添加量的確定

取5份納豆凍干粉，分別向其中加入納豆粉末質量2.0%，4.0%，6.0%，8.0%和10.0%的卡拉膠，混合均勻。按照表1的感官評價標準進行評分，結果見表10。

表10 卡拉膠添加量對納豆粉末口味的影響

2.4 正交試驗確定納豆粉末調味配方

在單因素試驗基礎上，選取葡萄糖添加量、食鹽添加量、環狀糊精添加量、卡拉膠添加量作為正交試驗的4個因素對納豆口含片配方進行優化，確定納豆粉調味的最佳添加組合。試驗結果如表11所示。

表11 納豆含片配方正交試驗結果

4個影響因子對納豆含片感官評分的影響程度為卡拉膠添加量＞環狀糊精添加量＞葡萄糖添加量=食鹽添加量。卡拉膠添加量的影響最大。納豆口含片最優配方組合為D2C3A1B2，即卡拉膠添加量4.0%、環狀糊精6.0%添加量、葡萄糖添加量6.0%、食鹽添加量6.0%。

3 結論

試驗對納豆的固態發酵條件進行優化，采用冷凍升華干燥法對納豆進行干燥處理，保護納豆激酶的活性不被破壞，并對納豆口含片的配方進行研究，確定納豆發酵的最佳條件和納豆臭味掩蓋的配方。納豆固態發酵條件為大豆浸泡pH 5，接種量6%，物料厚度3 cm，使用甘油作為碳源。納豆口含片配方為卡拉膠4.0%，環狀糊精6.0%，葡萄糖6.0%，食鹽6.0%。用優化后的發酵條件生產的納豆顏色艷亮油光澤，口感酥軟，濕潤，拉絲效果好，黏度很大，并有納豆特有香氣。干納豆粉碎后進行調味，臭味明顯得到改善，口味易于接受。