桑葉蛋白飲料的研制

祁芳，杜昕, ，張麗，秦瑞博，劉松青,

1.成都師范學院化學與生命科學學院（成都 611130）；2.成都師范學院食品發酵研究所（成都 611130）；3.特色園藝生物資源開發與利用四川省高等學校重點實驗室（成都 611130）

植物葉蛋白是世界上最大的可再生蛋白質資源之一，桑葉蛋白約占干基質量的25%[1]，且中國桑樹分布廣泛，桑葉資源豐富。桑葉中含有多種營養成分并具有一定藥用價值[2]，如：維生素B1、維生素B2及維生素C[3]有利于維持神經、心臟及消化系統的正常機能；黃酮、多酚等具有較強的抗氧化作用[4]。除此之外，桑葉中的多糖和生物堿可以調節血壓、血糖和降血脂等[5-6]。近年來，桑葉資源的研究逐漸活躍，產品開發成為熱點，桑葉被作為功能性食品原料生產桑葉面條、豆腐、調味醬等多種產品[7-9]。馬慧等[10]以鮮桑葉與桑葚為原料制作桑葚葉果汁飲料；谷薇薇等[11]以桑葉、葛根、苦瓜籽等為原料制備復合固體飲料；李盡哲等[12]以桑葉和蛹蟲研制出一款風味獨特、保健功能穩定的飲品，黃酮質量濃度達8.0 mg/mL；陳小敏等[13]研制的桑葉配方飲料能有效改善糖尿病小鼠多飲多食癥，抑制體質量下降，具有輔助降糖效果。在2018年的“全球創新食品領域投資交易項目”中，植物蛋白飲料交易額市場增長率達17%[14]，消費潛力巨大。

桑葉作為一種高蛋白食用資源，其經濟價值不可估量[15]。熊瑤[16]采用復合蛋白酶法提取辣木葉蛋白并制作辣木葉蛋白飲料，得出浸提液中蛋白質質量分數為0.17%，飲品蛋白質質量分數≥0.1%。王芳等[17]以0.4%的NaCl溶液為提取溶劑，料液比1∶30，超聲波400 W，超聲處理20 min，40 ℃水浴浸提桑葉60 min，葉蛋白得率為9.93%。楊晶等[18]研究NaOH、NaCl和水為浸提劑對桑葉蛋白提取的影響，得出以NaOH為浸提劑提取蛋白效果最佳。試驗采用超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白，并以浸提液為原料制作蛋白飲品，為葉蛋白的提取和精深加工奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

新鮮桑葉（品種為湖桑、荷葉白一號、大葉野生子、九龍拐；成都師范學院化學與生命科學學院試驗田）。

白砂糖、檸檬酸、蜂蜜（市售，成都市溫江區大潤發超市）。

1.2 試驗試劑

考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白、95%乙醇、85%磷酸、次甲基藍、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硫酸銅、氫氧化鈉、冰醋酸等（均為分析純）；葡萄糖為標準品。

1.3 試驗儀器

FA1004分析天平（常州幸運科技有限公司）；721可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；DHG-9140恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；HWS12恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；pH-10型筆式pH計（上海力辰邦西儀器科技有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 工藝流程

鮮桑葉→清洗、干燥、粉碎→超聲輔助水浴提取→過濾→調配→均質→殺菌、脫氣→產品

1.4.2 操作要點

1.4.2.1 原料處理

選用無病蟲害、無霉斑、無腐爛、外觀完整的優質新鮮桑葉，浸泡清洗，淋洗1次。用恒溫干燥箱將清洗好的桑葉進行干燥，除去水分后用超速粉碎機進行粉碎，便于桑葉中的有效成分提取。

1.4.2.2 超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白單因素試驗

超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白試驗基本參數設置：固液比1∶30（g/mL），在40 ℃下分別超聲30 min，于50 ℃水浴浸提1 h，以浸提液中蛋白質質量分數為檢測指標，分別考察超聲時間（20，30，40，50和60 min）、超聲溫度（30，40，50，60和70 ℃）、固液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70 g/mL）、水浴溫度（20，30，40，50和60 ℃）和水浴時間（20，40，60，80和100 min）這5個因素對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響，每組進行3次平行試驗。

1.4.2.3 超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白響應面試驗

在單因素試驗基礎上，選取影響較大的3個因素進行三因素三水平響應面設計，確定最佳工藝條件。

1.4.2.4 過濾

將浸提后的浸提液采用4層過濾紗布進行過濾，除去不溶性雜質。

1.4.2.5 飲品配方研制試驗

以感官評分為指標，分別考察桑葉浸提液添加量（30%，35%，40%，45%和50%）、檸檬酸添加量（0.10%，0.15%，0.20%，0.25%和0.30%）、白砂糖添加量（1%，2%，3%，4%和5%）和蜂蜜添加量（7%，8%，9%，10%和11%）對飲品質量的影響。在單因素試驗基礎上，選取影響較大的3個因素進行三因素三水平響應面設計，確定最佳產品配方。

1.4.2.6 均質

將調配好的桑葉飲料用均質機均質，獲得穩定的、液相均勻的飲品。

1.4.2.7 殺菌、脫氣

采用加熱的方式對飲品進行殺菌、脫氣處理。

1.4.2.8 灌裝

采用安全滌綸樹脂（PET）材質的塑料瓶進行灌裝，留整個容積6%的頂隙，得到產品。

1.4.3 指標測定

1.4.3.1 感官指標（見表1）

表1 感官評價表

1.4.3.2 理化指標

蛋白質，參照考馬斯亮藍法[19]測定蛋白質量分數，樣品稀釋倍數5倍；還原糖，參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》（直接滴定法）進行測定；pH，參考柑橘可溶性固形物和總酸質量分數測定方法比較[20]，采用手持式pH計進行測定；可溶性固形物，參考柑橘可溶性固形物和總酸質量分數測定方法比較[20]，采用手持式折光儀進行測定。

1.4.4 統計分析

利用Microsoft Excel 2010、Design Expert.V8.0.6.1、SPSS 24軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白單因素試驗

2.1.1 超聲時間對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響

從圖1可看出：隨著時間延長，浸提液中蛋白質質量分數逐漸增加，超聲50 min，浸提液中蛋白質質量分數最高，隨后降低。超聲使細胞破碎便于蛋白質溶出，超聲達到50 min后水溶性蛋白大部分溶出，繼續延長時間反而使其他可溶性物質溶出，影響蛋白質量分數的測定。由于超聲40和50 min對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響差異不顯著（p＞0.05），而超聲40 min可節省工藝時間，所以選擇超聲40 min為宜。

圖1 超聲時間對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響

2.1.2 超聲溫度對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響

從圖2可看出：超聲溫度40 ℃時，浸提液中蛋白質質量分數最高，隨后降低，而溫度70 ℃時又上升（p＜0.05）。造成這種現象可能原因是溫度過高，特別是超聲溫度超過50 ℃，熱效應使蛋白質開始變性聚集，從而影響桑葉蛋白質的提取，而在70 ℃時升高可能是此時高溫超聲具有去聚集作用，干擾蛋白質之間共價和非共價交聯。由于長時間高溫對儀器損害大，且高溫超聲將破壞浸提液中一些營養物質，所得蛋白質也失去活性，因此選擇超聲溫度30～50 ℃較為合適。

圖2 超聲溫度對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響

2.1.3 固液比對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響

從圖3可看出：固液比1∶30～1∶60（g/mL）之間蛋白質質量分數呈現先升高后降低趨勢，1∶60（g/mL）之后趨于平緩（p＞0.05）。這可能是由于固液比低時，浸提液黏度大導致蛋白溶出困難。料液比過高時，稀釋度太高，蛋白質質量分數則會相應較低。由于后續試驗需要用浸提液制作飲品，為節約成本又保證提取液中蛋白質質量分數，采用固液比1∶50（g/mL）為最佳。

圖3 固液比對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響

2.1.4 水浴溫度對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響

如圖4所示：隨著水浴溫度提高，浸提液中蛋白質質量分數也逐漸提高，水浴溫度60 ℃時達到最高（p＜0.01）。這可能是因為溫度低時，分子熱運動不夠劇烈，從而蛋白質分子溶解不出來，隨著溫度升高，分子運動加劇，更多蛋白質溶解出來。水浴溫度高于60 ℃，高溫使蛋白質變性，蛋白質質量分數降低。因此，選取50～70 ℃為最佳水浴溫度范圍。

圖4 水浴溫度對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響

2.1.5 水浴時間對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響

由圖5可知：在水浴60 min之前，浸提液中蛋白質質量分數隨著時間延長而逐漸增高，在60～80 min急劇下降（p＜0.05）。這可能是因為隨著時間延長，蛋白質開始凝聚，出現沉淀，在過濾時隨著殘渣一起被過濾掉，從而降低浸提液中蛋白質質量分數。因此，探究水浴時間40～80 min對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響。

圖5 水浴時間對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響

2.2 超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白響應面試驗

2.2.1 響應面模型建立

根據單因素試驗結果，選擇超聲溫度、水浴溫度、水浴時間3個變量設計響應曲面，超聲輔助水浴浸提的響應面因素水平見表2，試驗方案及結果見表3。

表2 超聲輔助水浴浸提的響應面因素水平表

對表3試驗數據進行回歸擬合，得到二次多元回歸模型：Y=1.90+0.16A+0.097B+0.44C-0.21AB+0.067AC-0.10BC-0.67A2-0.41B2+0.033C2。

表3 超聲輔助水浴浸提響應面試驗設計與結果

2.2.2 模型顯著性檢驗

模型的方差分析結果見表4。該回歸模型的p值小于0.05，模型顯著。失擬項p值（0.1362）大于0.05，失擬項檢驗不顯著，該模型的模擬精確。由模型總決定系數R2為0.9821可知，預測值和真實值之間具有高度相關性，因此可用該模型分析預測超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白的結果。一次項C極顯著，A、B顯著，二次項A2極顯著，B2顯著，C2不顯著，交互項除AB顯著外，其余交互效應均不顯著。根據F值判斷A、B、C這3個因素對桑葉浸提液中蛋白質質量分數的影響大小順序是C＞A＞B。

表4 回歸模型顯著性檢驗結果

2.2.3 響應曲面分析

由圖6可知：超聲溫度40 ℃、水浴溫度60 ℃時響應值達到最大值，超聲溫度與水浴溫度響應曲面陡峭且等高線呈橢圓形，交互作用顯著。超聲溫度一定時，隨著水浴溫度升高，提取液中蛋白質質量分數先增加后減小，水浴溫度一定時，隨著超聲溫度增加提取液中蛋白質質量分數呈現先上升后下降趨勢。其余交互作用不顯著。

圖6 超聲溫度與水浴溫度交互影響桑葉蛋白提取的曲面圖及等高線圖

2.2.4 驗證試驗

按照模型所得最佳提取工藝參數，選擇超聲時間40 min、超聲溫度42 ℃、固液比1∶50（g/mL）、水浴溫度60 ℃、水浴時間80 min進行3次重復試驗，所得浸提液中蛋白質質量分數為2.189%，與理論預測值相接近。因此，模型預測結果準確可靠。

2.3 飲品配方研制試驗結果

2.3.1 飲品研制響應面模型建立

根據單因素試驗結果，選擇桑葉浸提液添加量、蜂蜜添加量、檸檬酸添加量3個因素設計響應曲面，因素水平表見表5，響應曲面設計方案及結果見表6。

表5 飲品研制響應面因素水平表 單位：%

對表6的數據進行回歸擬合，得到二元回歸模型：Y=86.22-4.60A+0.41B+0.11C+1.65AB-0.45AC+4.83BC-1.22A2-3.50B2-6.05C2。

表6 飲品研制的響應面設計及結果

2.3.2 回歸模型顯著性檢驗

該模型顯著性檢驗結果如表7所示。該模型p值（p=0.0086）小于0.05，模型顯著，即回歸模型與實際測量值擬合程度很高。失擬項p值（0.0785）大于0.05，失擬項不顯著。該模型總決定系數R2為0.9012，說明預測值和真實值之間具有高度相關性，可用該模型分析預測飲品研制的結果。顯著性影響因素包括A、BC、B2、C2，其余項均不顯著。根據F值的大小可判斷試驗因素對飲品品質的影響，F值越大，則影響越大，因此可知A、B、C這3個因素對飲品質量影響的大小順序依次是A＞B＞C。

表7 回歸模型顯著性檢驗結果

2.3.3 響應曲面分析

由圖7可知：蜂蜜添加量與檸檬酸添加量的響應曲面陡峭，所以兩者之間交互作用顯著，等高線呈現橢圓形明顯。蜂蜜添加量9%、檸檬酸添加量0.2%時，響應值達到最高值。在蜂蜜添加量8.5%～9.5%、檸檬酸添加量0.18%～0.23%范圍內，感官評分響應值可達到最佳區域。檸檬酸添加量超過0.2%時，感官評分呈現降低趨勢。

圖7 蜂蜜添加量與檸檬酸添加量交互影響飲品質量的曲面圖及等高線圖

2.3.4 驗證試驗

根據模型所得飲品最佳配方，按桑葉浸提液添加量35%、蜂蜜添加量8.8%、白砂糖添加量3%、檸檬酸添加量0.20%進行驗證試驗，平行3次。試驗得出飲品感官評分為86.9分，結果與預測相符合。

2.4 理化指標的結果分析

理化指標的測定結果如表8所示，各指標均符合普通飲品要求。

表8 各指標測定結果

3 結論

在單因素試驗基礎上，選擇合適的濃度范圍，采用Box-Behnken響應面分析法對桑葉蛋白提取及飲品研制進行試驗。結果表明，桑葉以固液比1∶50（g/mL），在42 ℃下超聲40 min，在60 ℃溫度下水浴80 min，得到浸提液中蛋白質質量分數最高，可達2.189%；以桑葉浸提液制作飲品，添加35%浸提液、0.20%檸檬酸、3%白砂糖、8.8%蜂蜜，此配方下得出的飲品呈鮮亮黃綠色，色澤均勻，桑葉香氣濃郁，回味甘甜，滿足人們的嗜好。通過理化指標檢測，飲品pH 2.8，在正常飲料pH范圍內，還原糖為16.2%，可溶性固形物為10%，蛋白質為0.859%，均達到普通飲品的質量要求。試驗達到提高桑葉提取液中蛋白質質量分數的預期要求，研制出桑葉飲品最佳配方，對蛋白提取工藝的研究具有一定意義，為桑葉副產品深加工提供參考。