響應面法優化梅花鹿茸多肽口服液配方及穩定性

姜瑋，暢柯飛，張鐵華

吉林大學食品科學與工程學院（長春 130062）

鹿茸是傳統的名貴中藥材，俗有“東北三寶”之一的稱謂。據藥典記載，鹿茸具有壯腎陽、益精血、強筋骨、調沖任、托瘡毒等功效。還有研究顯示，鹿茸具有增強免疫[1-2]、抗炎[3-5]、促進傷口愈合[6]、抑菌[7]、改善腸道微生物菌群[8]等作用。

2014年，原國家食品藥品監管總局發布通知，指出在符合國家主管部門野生動物保護相關政策和規定情況下，允許養殖梅花鹿及其產品作為保健食品原料使用，拓寬養殖梅花鹿的使用范圍。吉林省是國內最大的鹿養殖基地，其中梅花鹿占85%～90%，開發鹿茸保健食品對于促進吉林省畜牧業發展、增加農民收入、振興地方經濟具有重要意義[9]。

市場化的鹿茸保健食品品種較少，多為片劑、粉劑、膠囊或者保健酒類，部分產品成分復雜，不利于特殊人群食用，如高血壓、高血糖人群等。此外，市場化的鹿茸口服液屬于藥品，不利于民眾接受和市場開拓。試驗從保健食品的角度，在實驗室酶解制備鹿茸多肽的基礎上，立足天然，明確劑量，研究開發食用型鹿茸多肽口服液，以達到豐富鹿茸產品類型、擴大市場的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

冷凍鮮梅花鹿鹿茸。

檸檬酸、木糖醇（均為食品級）；堿性蛋白酶；乙酸、檸檬酸、氫氧化鈉、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、乙醇、苯酚、檸檬酸鈉、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鎂、氯霉素、四氯四碘熒光素（虎紅溶液）、丙酮酸鈉、甘氨酸、氯化鋰、磷酸氫二鈉、結晶紫、草酸銨、碘、碘化鉀等（均為分析純）。

中藥切片機；萬能粉碎機；離心機；滅菌鍋；pH計；紫外可見分光光度計；海能全自動凱氏定氮儀；氨基酸分析儀。

1.2 鹿茸多肽制備

將冷凍鮮梅花鹿茸清洗干凈，去皮毛，采用中藥切片機切成0.2～0.4 mm薄片，采用萬能粉碎機粉碎，按料液比1∶150（g/mL）加入去離子水，加熱至90 ℃保持10 min，降溫至55 ℃，調pH 9.5～10，按5000 U/g加入堿性蛋白酶，酶解2 h，以12000 r/min離心，收集上清液，調pH 7，超濾，收集小于10 kDa的溶液，濃縮、凍干成粉末。

1.3 口服液配方設計

取一定量鹿茸多肽粉末，用去離子水按比例配制成溶液，加入不同量的檸檬酸、木糖醇調節口味。

1.3.1 感官評定標準

邀請40名經過訓練的食品專業學生，男女各半，依據GB/T 12312—2012《感官分析 味覺敏感度的測定方法》對鹿茸口服液進行感官評價，從色澤狀態、滋味、香味、澄清度4個方面進行評分，具體評定標準見表1。

表1 感官評價標準

1.3.2 配方設計

根據《中國藥典》（2015版）推薦食用量1～2 g/d，試驗中的梅花鹿茸中蛋白的質量分數為53%，則1 g干鹿茸生藥含530 mg蛋白質，即每天可攝入鹿茸蛋白530～1060 mg。按GB/T 10789—2015《飲料通則》的規定，蛋白飲料蛋白含量應≥0.5%，故按GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》，選用檸檬酸、木糖醇為調味劑，使用標準為按生產需要使用。

用0.15 mol/L乙酸、1 mol/L氫氧化鈉調節pH，加入檸檬酸和木糖醇調節口味。每組試驗配制100 mL，采用Box-Behnken設計進行配方篩選，通過感官評價，確定配方。

1.4 穩定劑篩選

選取評分最好的配方配制口服液，按照《中國藥典》（2015版）中化學藥物（原料藥和制劑）穩定性試驗指導原則的規定進行穩定性試驗。以離心沉淀率和穩定性系數為評價指標，考察鹿茸口服液的穩定性。

1.4.1 離心沉淀率

將配制好的口服液混勻后，按一定比例加入不同濃度的穩定劑混勻，準確稱取一定質量樣品，于4000 r/min離心處理15 min，倒掉上清液后，稱定沉淀的質量，每個樣品重復3次，計算離心沉淀率。一般情況下，離心沉淀率越低，產品越穩定。

式中：m1為沉淀物質量；m2為離心樣品質量。

1.4.2 穩定性系數

將配制好的口服液混勻后，準確稱取一定質量樣品，于4000 r/min離心處理15 min，吸取上清液，用去離子水稀釋（1∶20，φ），以水為空白對照，測定在200～400 nm處最大吸收峰的吸光度，離心前后吸光度的比值即為穩定性系數，每個樣品重復3次，計算穩定性系數。

式中：A1為離心后溶液最大吸收峰的吸光光度；A2為離心前溶液最大吸收峰的吸光度。

1.5 口服液理化指標測定

口服液中蛋白質質量分數參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》測定；可溶性固形物質量分數按GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》規定方法測定；鉛按GB 5009.12—2017《食品中鉛的測定》規定方法測定；砷按GB 5009.11—2014《食品中總砷及無機砷的測定》規定方法測定；氨基酸組成按GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》測定。

1.6 口服液微生物指標測定

依據GB/T 23784—2009《食品微生物指標制定和應用的原則》和GB 16740—2014《保健食品》規定，對口服液中的菌落總數、霉菌、酵母菌、致病菌進行檢測，具體參照GB 4789.2—2016《食品食品微生物學檢驗菌落總數測定》、GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》、GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》GB 4789.4—2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》和GB 4789.10—2016《食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》。

1.7 口服液穩定性試驗

將配制好的口服液裝瓶，于115 ℃滅菌30 min后，置于室溫保存6個月，分別于0，1，3和6個月取樣測定，測定多肽含量、菌落總數、pH及觀察口服液狀態。

1.8 統計分析

采用軟件Design Expert 10和SPSS Statistics 20進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 口服液配方試驗結果

感官評定是主觀判斷口服液的可接受度，感官評分越高，說明口味越好，接受度越高。口服液的配方設計和感官評定結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及因素水平表

以感官評定評分為響應值，利用Design Expert 10程序對感官評定結果進行回歸分析，得出編碼回歸方程Y=76-7.63X1+3.5X2+0.12X3+2.75X1X2+4.5X1X3+0.75X2X3+7.75X12-4.5X22+0.75X32。

得出實際因素的回歸方程Y=132-106.25X1+2.9X2-267.5X3+1.1X1X2+180X1X3+3X2X3+31.5X12-0.18X22+300X32。

在α=0.05顯著水平下對所得回歸方程進行顯著性檢驗與方差分析，分析結果見表3。回歸方程模型F=147.55，p＜0.0001，回歸模型是極顯著的；模型R2=0.9962＞0.95，Radj2=0.9895＞0.95，說明試驗值與預測值擬合度高；失擬項p=0.6812＞0.05，說明模型失擬值是極不顯著的，因此模型可以用于感官評定的預測。由于多肽的質量分數最低值至少為0.5%，故在指定范圍內，模型預測最優結果為多肽0.5%、木糖醇9.8%、檸檬酸0.03%，感官評分預測值為98.97分，試驗值與之相符，口感相比較好。

表3 模型方差分析

通過軟件Design Expert 10分析得到檸檬酸、鹿茸多肽、木糖醇3個因素兩兩交互作用，見圖1。鹿茸多肽含量和木糖醇含量變化對感官評價影響較大，多肽質量分數0.5%時，檸檬酸和木糖醇通過一定比例調配，感官評價顯示可以接受。但固定木糖醇、檸檬酸質量分數時，鹿茸多肽質量分數的變化對口服液感官評分影響明顯，這可能是鹿茸多肽具有明顯的特殊氣味，是導致鹿茸多肽口服液影響感官評定的主要因素。

圖1 鹿茸多肽、木糖醇、檸檬酸兩兩交互作用的曲面圖

2.2 口服液穩定劑篩選結果

為避免調配好口味的口服液放置有微小沉淀的現象，進一步考察穩定劑對口服液穩定性的影響。采用L9(34)進行優選，試驗值Yi與預測值Yi’見表4，通過極差分析，影響因素大小順序為C＞A＞B，即CMC-Na（C）＞三聚磷酸鈉（A）＞果膠（B）。綜合正交表確定的最適合組合為A3B3C2，即CMC-Na 0.04%、三聚磷酸鈉0.06%、果膠0.06%，口服液的離心沉淀率最低為3.19%。

表4 正交L9(34)篩選復合穩定劑的離心沉淀率

以穩定性系數為評價指標，試驗值Yi與預測值Yi’見表5。通過極差分析，影響因素大小順序為三聚磷酸鈉（A）＞果膠（B）＞CMC-Na（C），綜合正交表確定的最適合組合為A3B3C2，即三聚磷酸鈉0.06%、果膠0.06%、CMC-Na 0.04%，穩定系數為87.54%，與口服液的沉淀率研究結果一致。

表5 正交L9(34)篩選復合穩定劑的穩定性系數

2.3 口服液理化指標測定結果

鹿茸多肽口服液的理化測定結果顯示（表6），可溶性固形物、鉛、砷均滿足相關要求，蛋白質質量分數為0.50%～0.52%。

表6 理化指標

對口服液的氨基酸組成進行分析，具體結果如表7所示。必需氨基酸的總量占比20.45%；非必需氨基酸中甘氨酸含量最高，其次為谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸和天冬氨酸，與王艷梅[10]、魏越[11]研究結果趨勢一致。

表7 口服液中16種氨基酸質量濃度

2.4 口服液微生物指標測定結果

按照相關規定，在配制的幾個批次樣品中，致病菌、霉菌、酵母菌在所有樣液中均未檢出，少數幾個樣品檢出大腸桿菌，研發的鹿茸多肽口服液的微生物指標符合國家標準要求，見表8。

表8 微生物指標

2.5 口服液貯藏試驗結果

將口服液室溫放置、避光條件下貯存6個月后，貯藏試驗結果具體見表9。微生物指標測定符合GB 16740—2014《食品安全國家標準保健食品》的要求，產品營養成分變化較小并且感官性狀無明顯變化，略有少量沉淀，不影響產品質量，在產品可接受范圍內。

表9 貯藏試驗結果

3 結論

結果表明，鹿茸多肽質量分數0.5%、木糖醇9.8%、檸檬酸0.03%，口服液口味較好。穩定劑CMC-Na 0.04%、三聚磷酸鈉0.06%、果膠0.06%時，離心沉淀率最低為3.19%，穩定系數為87.54%，即口服液的穩定狀態最好。口服液的理化指標和微生物指標都符合國家標準要求。養鹿業是吉林省重要的特色優勢產業之一，在振興東北老工業基地的大環境下，提高養殖梅花鹿的精深加工產品的生產規模和附加值，運用生物工程技術，提升產品品質，打造地域特色鮮明的產品，具有實際意義。