艾葉多糖的分離純化、結構表征及抗氧化活性

陳同強 ，李燦 ，郭錦材，徐文泱 ，何青科，李凱龍

1.湖南省產商品質量檢驗研究院（長沙 410007）；2.食品安全監測與預警湖南省重點實驗室（長沙 410111）；3.長沙市口腔醫院（長沙 410006）；4.湖南省植物保護研究所（長沙 410125）

艾葉，為菊科植物艾（Artemisia argyiLevl.et Vant.）的干燥葉，廣泛分布于我國大部分地區。其藥用價值主要包括溫經止血、散寒止痛；外用有祛濕、驅蚊、止癢等功效[3]。艾葉的嫩芽及幼苗可作蔬菜食用，在民間還有把采摘的艾葉和糯米一起制成“蒿子糍粑”的習俗。研究表明艾葉中除主要成分揮發油外，還含有黃酮、萜類、多糖等有機化合物成分[2-3]。

多糖由10個（含）以上的單糖通過糖苷鍵縮聚而成，主要分為植物多糖、動物多糖及微生物多糖3類。大量的藥理以及臨床試驗表明，多糖類化合物能夠激活人體免疫細胞，從而提高機體的免疫力，且對正常細胞幾乎無毒副作用[4]。

目前對艾葉多糖研究主要包括提取工藝、抗氧化作用、抗腫瘤作用以及免疫調節等[5-7]，而對艾葉多糖的分離純化、結構表征及純品組分抗氧化活性研究報道鮮見。試驗通過對艾葉水提取乙醇沉淀得到粗多糖，再經脫色、脫蛋白、柱色譜分離純化等過程處理后最終得到2種純多糖組分。通過對2種多糖化合物的糖含量、單糖組成、相對分子質量、分子特征等指標以及其體外抗氧化活性進行研究分析，為進一步研究艾葉中多糖的構效關系以及艾葉的綜合開發和利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

干燥艾葉（粉碎至約0.250 mm孔徑大小，備用）；單糖標準物質（L-鼠李糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、肌醇、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸）、肌醇（內標），中國藥品生物制品檢定所；陰離子交換纖維素DEAE-52（英國Whatman公司）；葡聚糖凝膠Sephadex G-200（百浩天生物科技有限公司）；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

透析袋（截留分子質量3500 Da，上海易佰聚經貿有限公司）；高效液相色譜儀（美國Waters 600；紫外可見檢測器DAD，示差檢測器RI，UltrahydrogelTM1000、500色譜柱，7.8 mm×300 mm，美國Waters）；十八角度激光散射儀（MALLS）；氣相色譜儀GC-2010（日本島津），配OV-101石英毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.33 μm）；BS-100N自動部分收集器，恒流泵BT100N數顯恒流泵（上海青浦滬西儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖的提取

艾葉多糖的提取參照文獻[8]的方法進行。稱取1 kg干燥艾葉，搗碎，使用體積分數為95%的乙醇回流除去脂肪，殘渣于90 ℃烘箱烘干后稱其質量，用20倍量的水在80 ℃的條件下提取2 h，過濾，重復提取1次，合并濾液，濃縮至一定體積，離心，取上清液，在不斷攪拌下加入95%乙醇使得溶液中乙醇的最終體積分數為70%（V/V），靜置過夜，離心，收集沉淀，冷凍干燥，得到粗多糖，命名為AY。

1.3.2 AY的分離純化

AY通過Savag法除蛋白和H2O2法脫色素[9]后，樣液濃縮至一定體積，再按1.3.1方式醇沉2次，將得到沉淀溶解于水中，用自來水流水透析48 h，冷凍干燥，備用。

準確稱取經上述處理后的AY（200 mg）置于醋酸鈉-醋酸（NaAc-HAc）緩沖鹽（pH 5.2）溶液中，溶脹過夜，過陰離子交換柱（DEAE-52，Cl-，2.5 cm×70 cm，填料纖維素陰離子交換劑DEAE-52依次經0.2 mol/L NaOH、0.2 mol/L HCl處理1 h，蒸餾水洗至中性）。先用NaAc-HAc緩沖鹽（pH 5.2）平衡過夜，上樣，先后用含0，0.1和0.3 mol/L NaCl的NaAc-HAc緩沖鹽（pH 5.2）流動相洗脫，流速均為5 mL/10 min，以苯酚-硫酸法（490 nm）[10]隔管示蹤，以奇數管號為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制曲線，收集合并主峰部分，透析，冷凍干燥。

準確稱取將上述洗脫所得多糖（100 mg），過凝膠Sephadex G-200柱（2.6 cm×90 cm），Sephadex G-200葡聚糖凝膠預先用0.02% NaN3水溶液浸泡48 h，蒸餾水平衡1 d，裝樣，蒸餾水洗脫，流速為0.5 mL/min，每管收集約5 mL，采用苯酚-硫酸法測A490示蹤，繪制曲線，收集主峰部分，冷凍干燥。

1.3.3 多糖的相對分子質量與分子特征分析

試樣制備：準確稱取純化多糖樣品，流動相配制成5 mg/mL溶液，經0.22 μm濾膜過濾，用高效凝膠色譜-十八角度激光散射聯用技術（HPGPC-MALLS）分析。

色譜條件：色譜柱，UltrahydrogelTM1000、500色譜柱串接；流動相，含0.02% NaN3的0.1 mol/L NaNO3溶液；流速0.8 mL/min；柱溫40 ℃；MALLS的光源氣體，氦氣、氖氣；波長690 nm。流動相的折光指數1.298；組分在溶液中的折光指數增量（dn/dc）測得值約0.128；校準激光的儀器常數7.8059×10-6（V·cm）-1，校準示差折光檢測器儀器常數2.1455×10-4（V·cm）-1。

1.3.4 單糖組成分析

標準品及樣品處理參考文獻[11]。

氣相色譜（GC）條件：進樣口溫度250 ℃；進樣模式，分流，分流比10∶1；進樣體積1.0 μL；檢測器溫度280 ℃。程序升溫：160 ℃，保持4.0 min，以5℃/min升至190 ℃，保持4.0 min，然后以3 ℃/min升至最終溫度210 ℃，保持15.0 min，最后以10 ℃/min升至260 ℃，保持5 min。

1.3.5 抗氧化活性分析

將分離純化后的艾葉多糖組分配制成質量濃度分別為0，0.1，0.2，0.5，0.8和1.0 mg/mL的多糖系列溶液，參照文獻[12-14]方法，測定艾葉多糖組分對DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基3類自由基的清除率，上述試驗均采用維生素C（VC）作為陽性對照。

2 結果與討論

2.1 粗多糖（AY）的分離純化

AY脫蛋白色素處理后，經DEAE-52 Cl-離子交換柱色譜分離，用含0.1 mol/L NaCl的NaAc-HAc緩沖鹽（pH 5.2）流動相洗脫得到AY-1，AY-2和AY-3這3個組分多糖，如圖1所示，因AY-2和AY-3濃度較低，富集相對困難，選擇AY-1進一步分離純化。將AY-1經SephadexG-200凝膠柱色譜純化，得到兩個多糖組分，見圖2，分別集中收集，用自來水流水透析1 d，蒸餾水磁力攪拌透析1 d，濃縮，冷凍干燥，分別命名為AY-1A和AY-1B。

圖1 AY的陰離子交換纖維素柱色譜洗脫圖

圖2 AY-1的凝膠柱色譜洗脫圖

2.2 AY-1A與AY-1B兩個組分純度鑒定與理化分析

AY-1A與AY-1B兩個組分色譜出峰均呈現單一對稱峰，說明兩個多糖組分純度較高，紫外光譜圖為典型的多糖吸收光譜，且在波長280 nm與260 nm處吸收很弱，排除了AY-1A與AY-1B為糖蛋白（或蛋白糖）與核酸的可能性。經苯酚硫酸測得AY-1A與AY-1B兩個組分中多糖質量分數分別為95.8%和97.3%。

2.3 AY-1A與AY-1B分子特征分析

表1顯示：AY-1A的重均分子質量（MW）高于AY-1B，AY-1A的多分散系數MW/Mn=2.048，處于2～3之間，屬于中等分布寬度樣品；AY-1B多分散系數接近于1，屬于窄分布樣品，當MW/Mn=1時，則認為樣品的相對分子質量分布是均一的。

表1 AY-1A與AY-1B的分子特征參數

AY-1A與AY-1B的Rg都較小，AY-1A的Rg要小于AY-1B的Rg，這與重均分子質量大小順序剛好相反，分析原因是由AY-1A在該電解質（鹽）溶液（0.1 mol/L NaNO3）中分子形狀發生皺縮而引起分子尺寸大小降低造成的。

對AY-1A與AY-1B的Rg與Mw分別繪制曲線，由Astra處理軟件計算得，AY-1A的斜率為0.32±0.02，如圖3所示，而AY-1B的線性關系較差，類似U型曲線，如圖4所示。一般來說，當斜率為1時，表示高分子在溶液中是棒狀排列；當斜率為0.4～0.6時，則表示高分子在溶液中呈線性無規則線團；當斜率約為0.33時，則表示為球狀形態[15]。由此可知：AY-1A在流動相溶液中呈球形構象；AY-1B結構則呈典型的高枝化度結構，這是因為相同分子質量的支鏈化多糖與線形多糖相比較，枝化多糖分子的旋轉半徑要更大，從而引起曲線彎折，如U型。

圖3 AY-1A的均方根旋轉半徑（Rg）與重均分子質量（MW）之間的關系

圖4 AY-1B的均方根旋轉半徑（Rg）與重均分子質量（MW）之間的關系

2.4 單糖組成分析

通過與標準單糖保留時間的比較分析確定單糖組成，如圖5所示，并采用內標法定量計算組成單糖的摩爾比例。AY-1A是由葡萄糖組成的均多糖，如圖6所示；AY-1B則為由阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸組成的酸性雜多糖，如圖7所示。單糖組成的摩爾比例為c阿拉伯糖∶c半乳糖∶c半乳糖醛酸=50.27∶40.59∶9.14，其中阿拉伯糖與半乳糖含量較高。

圖5 混合單糖標準品的GC圖

圖6 AY-1A的的單糖組成GC圖

圖7 AY-1B的單糖組成GC圖

2.5 抗氧化活性分析

圖8（A）顯示：艾葉多糖AY-1A與AY-1B對DPPH、羥自由基、ABTS自由基的清除能力具有一定的量效關系，隨著多糖濃度的升高而逐漸增強。DPPH清除率在AY-1A與AY-1B 0.0～0.4 mg/mL質量濃度范圍內均明顯上升，當AY-1A與AY-1B質量濃度為1.0 mg/mL 時，兩者清除率達到最大值，分別為55.29%與65.97%，而陽性對照品VC對DPPH自由基的清除率則高達98.50%。

圖8（B）顯示：當AY-1A與AY-1B質量濃度達到0.5 mg/mL后，增長速率均趨于平緩，當質量濃度為1 mg/mL時，AY-1A與 AY-1B對羥自由基清除率分別達到最大值（40.37%和53.23%）。

圖8（C）顯示：在質量濃度 1.0 mg/mL的AY-1A與 AY-1B中，清除ABTS自由基的活性最大值分別為21.08%與37.91%。

圖8 AY-1A與AY-1B DPPH自由基（A）、羥自由基（B）、ABTS自由基（C）清除效果

綜上所述，AY-1A與 AY-1B均具有一定清除自由基能力，且AY-1B總體抗氧化活性強于AY-1A。這種差異性可能原因是AY-1B結構中含有一定比例易電離基團，如糖醛酸等。其抗氧化機理與多糖結構的關系尚需進一步研究。

3 結論

通過對艾葉中多糖采用水提醇沉得到粗多糖，粗多糖經除蛋白脫色素處理，先后經陰離子DE-52交換柱色譜、Sephadex G-200葡聚糖凝膠色譜分離純化，最終得到AY-1A與AY-1B兩個多糖組分。結構表征結果顯示AY-1A為由葡萄糖構成的均多糖，AY-1B為由半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸組成的酸性雜多糖。AY-1A在0.1 mol/L NaNO3溶液中呈球形構象，AY-1B則呈高度支鏈化分子結構；抗氧化活性試驗證實，AY-1A與AY-1B均具備一定清除自由基能力，且AY-1B總體抗氧化性強于AY-1A，結果表明艾葉多糖具備被開發成天然抗氧化劑的前景，同時為艾葉在醫學、化妝品以及食品工業等領域的開發與利用奠定了良好的基礎。