不同形態多酚枇杷葉提取物活性及其應用研究

郭松斌，楊韌強，柯文林

福建中煙工業有限責任公司技術中心（廈門 361012）

在中國，枇杷葉被廣泛用作功能性食品及中藥制劑的重要來源，枇杷葉中含有各種生物活性化合物，包括酚酸、黃酮類化合物和多糖[1]。其中，多酚具有較強的抗氧化活性，可防止活性氧（ROS）損傷、DNA突變、糖尿病、心血管疾病和心臟病[2-4]。

研究表明，枇杷葉的酚類化合物與其他類似植物一樣，通常以可溶性游離、可溶性和不溶性結合的形式存在。研究報道，特定的Grindamyl果膠酶輔助提取已成功地用于提高黑加侖中多酚的回收率[5]，纖維素酶和阿魏酰酯酶可顯著促進麥麩酚類化合物的釋放[6]，纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、半纖維素酶和葡聚糖酶可以有效地從未成熟的蘋果中釋放酚類化合物[5,7-8]，但尚未見到酶在枇杷葉上的應用的報道?；诖?，此次研究的主要目的是：（1）研究酶輔助提取方法得到不同形態多酚提取物；（2）比較不同酶提取枇杷葉中酚類提取物的抗氧化活性；（3）測定酶提取枇杷葉中可溶性酚類提取物對DNA損傷的保護作用；（4）評價復合酶提取枇杷葉可溶性酚類提取物對卷煙感官質量的影響。

1 試驗材料與方法

1.1 原料和試劑

多酚標準品（＞99.5%）、Folin-Ciocalteu的苯酚試劑、過硫酸鉀、FeCl3、Trolox、ABTS、DPPH：Sigma-Aldrich；MiniBEST質粒純化試劑盒、pMD-18T質粒DNA（Takara Biotechnology）；纖維素酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、復合酶（包括纖維素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶）Youtell Biochemical。

枇杷葉，市售。

1.2 儀器和設備

RE52-99旋轉蒸發儀（上海亞榮生化器材廠）；OLB-110DW恒溫水浴振蕩器（山東博科科學儀器有限公司）；常規煙支打煙器（荷蘭MASCOTTE公司）；MP1100B電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；HS-4水浴鍋（上海醫療器械五廠）；HY-727SPC型分光光度計（無錫市英之誠高速分析儀器有限責任公司）；恰爾TDL-5A臺式離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）。

1.3 酶法處理樣品過程

在錐形瓶中分別加入5 g研磨后的枇杷葉和20 mL H2O（預先用0.02 mol/L檸檬酸調節到pH 5.0），分別編號，按照表1加入對應的酶，后將錐形瓶置于50 ℃恒溫振蕩水浴鍋中12 h后，將樣品放置于80 ℃烘箱中20 min使酶失活；最后將樣品在60 ℃條件下處理15 h，收集酶預處理后的干燥枇杷葉，備用。

表1 酶法處理枇杷葉樣品所需酶種類及添加量

1.4 酚類組分的提取

取1 g 1.3小節中酶預處理后的枇杷葉，加入10 mL 70%的甲醇，在40 ℃條件下回流提取1 h，將混合物過濾后分別收集上清液和固體沉淀。其中，上清液中再加入70 mL乙酸乙酯進行萃取，萃取3次，分別合并乙酸乙酯萃取相和水相，將萃取液至于旋蒸儀上除去乙酸乙酯，萃取物中加入5 mL 50%甲醇溶解后，在-20 ℃條件下暫存，得到游離酚類（FP）組分；在水相中加入40 mL 2 mol/L的 NaOH水解4 h，后用12 mol/L HCl酸化至pH 2.0；在酸化后的水相中加入70 mL乙酸乙酯進行萃取，處理過程及樣品保存方式同前所述即可得到可溶性結合酚類（SCP）物質；在固體沉淀中加入50 mL 2 mol/L的NaOH，在室溫下水解4 h，后用12 mol/L HCl酸化至pH 2.0。收集酸化后的上清液，用乙酸乙酯進行萃取，萃取液處理方式同前所述，即得到不溶性結合酚類（IBP）。

1.5 ABTS自由基陽離子（ABTS+）清除活性

ABTS分析方法見參考文獻[9]。

1.6 DPPH自由基清除活性

DPPH測定見參考文獻[10]。

1.7 還原鐵抗氧化能力（FRAP）測定

FRAP的分析方法見參考文獻[11]。

1.8 超螺旋DNA鏈斷裂的抑制作用

采用Liyana-Pathirana等[12]方法，并稍加改動。將10 μL的可溶性酚類提取物（2 mg/mL）、5 μL pMD 18-T質粒DNA（200 ng/μL）以及10 μL Fenton試劑混合，混合物避光，在37 ℃條件下培養30 min。以槲皮素為陽性對照，磷酸鹽緩沖液作為空白對照。用超螺旋DNA的相對百分比來評估可溶性酚類提取物對DNA的保護作用，如式（1）所示。該數值越小表示樣品對超螺旋DNA的保護作用越小。

式中：Is為超螺旋DNA的比例；IN為開環DNA的比例。

1.9 統計分析

所有試驗重復3次，結果以“平均值±標準差（SD）”表示。使用SPSS 13.0統計軟件（StatSoft，Tulsa，OK，USA）進行單因素方差分析。

1.10 感官評價

將試驗所得的多酚提取物按一定的添加量添加到卷煙料液中吸收2 h，在105 ℃的烘箱中烘干并平衡水分后進行打煙制樣，由感官評價小組參考中式卷煙感官評價的方法進行打分。

2 試驗結果與討論

2.1 酶輔助提取法生物活性的變化

試驗采用3種抗氧化評價模式來評價不同酶輔助提取后枇杷葉提取物中多酚類活性的變化。表2～表4分別為不同酶輔助提取枇杷葉中的FP、SCP、IBP和總多酚（TSP）對ABTS+、DPPH的清除能力及對還原鐵的抗氧化能力。結果顯示：與對照組相比（未添加酶），在提取過程中添加纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、復合酶可提高FP、SCP和TSP的ABTS值，復合酶效果最明顯；在枇杷葉提取過程中添加木聚糖酶并不會顯著增加可溶性酚類物質，相反，可溶性酚類ABTS值略有下降。

表2 不同處理方式下不同結合態多酚類化合物ABTS值

表3 不同處理方式下不同結合態多酚類化合物的DPPH值

表4 不同處理方式下不同結合態多酚類化合物的FARP值

2.2 對DNA損傷的保護作用

試驗對枇杷葉多酚對DNA損傷的保護作用進行了研究。由圖1和圖2可知：芬林試劑直接與超螺旋質粒DNA孵育后對超螺旋DNA造成了損傷；而在孵育體系中加入纖維素酶、β-葡萄糖苷酶或復合酶酶解提取的枇杷葉多酚物質后，超螺旋DNA的比例有較大的提高，說明枇杷葉多酚可起到對DNA損傷的保護作用；但在木聚糖酶解組未觀察到此現象，可能是由于在枇杷葉提取過程中添加木聚糖酶并沒有提高枇杷葉多酚的含量，因此不能清除芬林試劑中的羥自由基，這驗證了前面的抗氧化活性結果。

圖1 不同酶輔助提取方法的可溶性酚類對Fenton試劑誘導保護作用

圖2 不同提取產物可溶性酚類對Fenton劑誘導的DNA氧化的保護作用

2.3 不同形態的多酚枇杷葉提取物在卷煙中加料應用

將復合酶處理后制備的3種不同形態多酚類枇杷葉提取物按照0.04%的比例以加料的方式在卷煙中進行應用，評吸小組的評價結果如表5所示。結果顯示：游離態枇杷葉提取物在卷煙中加料應用后的感官評價效果最好，能增加青香香韻，提調卷煙清甜香，改善香氣質感，煙氣濃度稍有提升，甜感舒適自然；可溶性結合態枇杷葉提取物青香風格雖有所保留，濃度上有所增加，但香氣的清晰明亮度上會有所下降，口腔出現干燥感；而不可溶性結合態多酚的枇杷葉提取物在卷煙中應用后雖然煙氣濃度增加，但特征風格較弱，煙香的質感下降，香氣顯渾濁，口感稍欠。

表5 不同形態多酚的枇杷葉提取物對卷煙感官品質的影響

試驗進一步研究了添加不同比例的游離態枇杷葉提取物對卷煙感官評價的影響，感官評價小組的評吸結果見表6～表8及圖3。

圖3 0.04%添加游離態枇杷葉提取物對卷煙感官質量的影響

表6 不同添加比例的游離態多酚枇杷葉提取物香氣風格感官評價結果

表7 不同添加比例的游離態多酚枇杷葉提取物口味風格感官評價結果

表8 不同添加比例的游離態多酚枇杷葉提取物舒適性特征及煙氣特征感官評價結果

隨著游離態多酚枇杷葉提取液添加比例的提高，卷煙的多項感官評價指標均有所改善，游離態多酚枇杷葉提取液可提調卷煙清甜香風格，增加青香香氣，提升煙氣濃度和厚實飽滿感，增加甜感，舒適性上也有所改善。但當添加比例達到0.06%時，抽吸時顯著提升的青香香韻與煙香的協調性較差，煙氣的細膩柔和程度逐漸下降，同時對卷煙的舒適感造成一定的負面影響，具體表現為刺激增大、喉部的干燥感和口腔殘留感等。因此，此游離態多酚枇杷葉提取物在卷煙中較合適的添加比例為0.04%。

3 結論

與未添加酶處理組相比，添加纖維素酶、β-葡萄糖苷酶或復合酶輔助提取均可顯著提高可溶性多酚物質的抗氧化活性，其中復合酶處理的效果最為明顯。

與未處理組相比，枇杷葉經纖維素酶、β-葡萄糖苷酶或復合酶處理后，提取得到的可溶性多酚物質顯示出對超螺旋DNA較好的保護作用，而在木聚糖處理組未觀察到此現象。

使用復合酶輔助提取枇杷葉，其制備的游離態枇杷葉提取物在卷煙中應用后可改善卷煙的感官質量：能提調卷煙清甜香，改善香氣質感，提升煙氣濃度，甜感舒適自然，且在煙絲中最佳的添加量為0.04%。