大蒜提取物超氧化物歧化酶對醬腌菜品質影響

韓曉磊，梁玨欽，楊慧，王龍泉，熊智，呂慧英

1.湖南省農業科學院農產品加工研究所（長沙 410125）；2.湖南省食品測試分析中心（長沙 410125）；3.湖南省農業信息與工程研究所（長沙 410125）；4.西南林業大學（昆明 650224）

醬腌菜是腌菜和醬菜等的總稱[1]，蔬菜制品經過醬、鹽、糖、醋等腌制加工后的產品稱為醬腌菜[2]。醬腌菜作為居民日常生活飲食的傳統開胃小菜和休閑食品，具有鮮甜脆嫩或咸鮮辛辣等獨特味道，受到大眾歡迎。采摘后蔬菜瓜果的生長代謝和腌制中微生物作用是亞硝酸鹽產生的主要來源[3]，在加工腌制中在細菌還原酶等作用下，大量的硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽，易導致過量的亞硝酸鹽累積，從而使食用安全性和產品營養品質大幅下降[4]，長期食用過量的亞硝酸鹽是引發人體急慢性中毒和癌癥的重要誘因[5]。近年來，醬腌菜亞硝酸鹽超標事件時有發生，嚴重威脅大眾身體健康。我國大蒜資源非常豐富，大蒜除含有硫胺素、核黃素、尼克酸、蒜素等化學物質外，還可以通過酶解和化學反應產生多種活性成分，如中二烯丙基三硫化物、二烯丙基二硫化物以及超氧化物歧化酶等，使得大蒜具有廣譜抗菌消炎、抗癌等生理功效[6-10]。超氧化物歧化酶（SOD）是一種廣泛存在天然動植物體內的酸性蛋白，近年來研究表明大蒜中含有較為豐富的SOD，而且利用效率較高[11]，為大蒜提取物在果蔬抑菌、保鮮和對亞硝酸鹽降解等方面提供重要的原料基礎，研究其抗菌保鮮具有現實意義。目前，對亞硝酸鹽的降解主要集中在人工接種發酵以及添加抗氧化劑等方面，多數是利用大蒜提取液中揮發油、汁及浸出液中所含有大蒜素、大蒜辣素等成分進行亞硝酸鹽等有害成分降解[12-16]。有研究表明大蒜SOD還可作為抗氧化劑有效防止罐頭、果汁等食品的變質及腐敗現象[17]。而大蒜SOD清除亞硝酸鹽以及對醬腌菜腌制中積累的亞硝酸鹽進行清除和貯藏中營養品質影響的研究還未見相關報道。

試驗以大蒜為基礎原料，利用不同提取方法，采用實驗室檢測手段，探究其SOD提取物對醬腌菜亞硝酸鹽清除效率和營養品質影響規律，以期在醬腌菜生產貯藏中開發一種來源廣泛且安全無毒的天然抗菌保鮮劑，為保障醬腌菜安全和營養品質健康和大蒜綜合利用開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑、設備

材料：新鮮大蒜（白皮、紫皮）；青菜、白菜等腌制蔬菜原料，精制食鹽及腌制瓷罐等材料均為市售，原料采購后于4 ℃冰箱冷藏保存備用。

試劑：木瓜蛋白酶（2000 U/mg），東恒華道生物科技有限責任公司；三羥甲基氨甲基烷（99.5%）、焦性沒食子酸（99.0%）、DPPH（Sigma D9132-100 mg 97%）、亞硝酸鹽標準樣品、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、濃硫酸、鹽酸、磷酸、三氯甲烷、乙醇、活性炭、硼砂等，試驗中所用試劑均為分析純，用水均為去離子水。

主要儀器與設備：AL-204型電子天平，美國梅特勒-托利多公司；UV-1700紫外可見光分光光度計，日本島津；PHB-4型pH計，雪磁；HR/T16M型高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；電子恒溫水浴鍋、超純水系統、臺式離心機、酸堿滴定管、榨汁機、磁力攪拌器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 大蒜SOD活性測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定。SOD酶活性定義：在1 mL反應液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時的酶量為一個活性單位。酶活力值表示：酶活力（U/g）=[（ΔA325-ΔA′325）×100%×4.5×2×D×V1/（ΔA325×V×m1）]。式中：ΔA325為鄰苯三酚自氧化速率；A′325為樣液或SOD酶液抑制鄰苯三酚自氧化速率；V為加入樣液或酶液體積，mL；D為酶液或樣液稀釋倍數；V1為樣液總體積，mL；m1為樣品的質量，g。

1.2.2 大蒜SOD提取物抗氧化能力測定

采用紫外分光光度法測定，以提取物對DPPH自由基清除效率表示抗氧化能力，其清除率計算公式：清除率=[1-（Ai-Aj）/A0）]×100%。式中：Ai為未加大蒜提取物時溶液的吸光度；Aj為加入大蒜提取物后溶液的吸光度；A0為大蒜提取液的吸光度[18]。

1.2.3 亞硝酸鹽和營養品質指標測定

亞硝酸鹽采用鹽酸萘乙二胺法測定，并以清除率為衡量指標。清除率計算公式：清除率=（A1-A2）/A1×100%；式中：A1為未加大蒜提取物時的吸光度；A2為加入大蒜提取物時的吸光度。

菌落總數參照GB 4789—2010《食品微生物學檢驗菌落總數測定》方法測定，可溶性糖采用蒽酮比色法測定，總酸采用GB/T 123456—2008中酸堿滴定法測定，氨基酸態氮測定采用GB/T 13662—2008中滴定法測定。

2 提取與測定

2.1 大蒜SOD提取物的制備與純化

采用磷酸緩沖液法對白皮大蒜、紫皮大蒜（各2000 g樣品）進行提取，首先將蒜瓣去外膜，于攪拌機攪拌10 min，然后移至研缽中研磨至蒜泥狀，加入2倍樣品體積的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液和5 g木瓜蛋白酶，用榨汁機使其組織破碎后勻漿。在40 ℃恒溫攪拌器上攪拌35 min，調至pH 6，在4 ℃條件下浸提過夜，用6層紗布抽濾，如此反復共3次，收集3次抽濾所得初濾液，以6000 r/min離心10 min，得上清液。采用熱變性法、丙酮沉淀法對提取的粗酶液進行純化。將粗酶液分成兩份，一份于60 ℃熱處理10 min，以8500 r/min離心10 min，另一份加入0.6倍體積的丙酮，攪拌15 min。兩份分別于旋轉蒸發器濃縮并于45 ℃熱風干燥至粉末狀，得到純化的大蒜SOD提取物[17]，分別測定提取物抗氧化能力及酶活力值。

2.2 醬腌菜的制備與提取物的添加

以大白菜、青菜共5 kg為原料，洗凈殺青、瀝干，按照傳統工藝腌制，均勻分成5份，每份添加12%的精制食鹽，混勻，裝入編號為A1～A5的5個腌制瓷罐中，分別添加0.0%，0.1%，0.2%，0.3%和0.5%質量分數的大蒜SOD提取物于瓷罐中，混勻，壓緊蓋上瓷蓋，并以純凈水水封密封，此腌制試驗共三平行，保存在恒溫培養箱（25 ℃）中腌制，分別于5，10，15，20和30 d取出適量待測樣品，測定亞硝酸鹽質量分數及清除效率；將腌制30 d后的A1樣品均勻分成5等份，共2平行，對應添加0.0%，0.1%，0.2%，0.3%和0.5%質量分數的大蒜SOD提取物，混勻，真空包裝后于室內常溫貯藏，分別于0，10，20，30，40，60和90 d對菌落總數、總酸、可溶性糖、氨基酸態氮進行的測定，每個試驗重復3次，測定結果以平均值表示，分析其結果。

3 結果與分析

3.1 大蒜SOD提取物抗氧化能力測定

DPPH是一種穩定的有機自由基，溶于乙醇時溶液呈深紫色，該溶液在波長517 nm處有強的吸收。當有自由基清除劑存在時，可與其單電子配對使其溶液褪色吸收降低，其褪色程度與其所接受的電子數呈線性關系，因此可以用光度法檢測自由基的清除情況，從而評價自由基清除劑即樣品的抗氧化能力[18]。試驗時，共三平行，準確吸取5 mL的提取液于10 mL比色管中，然后加入2.0 mL 0.8 mg/mL DPPH溶液，用水定容至刻度，在室溫下反應30 min，在波長517 nm處測定吸光度。由圖1可知，兩種提純方法大蒜SOD提取物對DPPH均具有較強的清除能力，且對DPPH清除率均隨大蒜提取物用量的增大而增強，具有較明顯的量效關系，大蒜SOD提取物對DPPH清除力大排序為磷酸緩沖液法+丙酮沉淀法＞磷酸緩沖液法+熱變性法＞磷酸緩沖液法。

3.2 大蒜SOD提取物酶比活力值測定

由表1可知，兩種不同大蒜樣品經過不同提取純化方法得到的大蒜提取物SOD酶比活力均有不同，但品種間SOD活力值差異不顯著（p＞0.05），回收率均較好，經過熱變性和丙酮沉淀法，總蛋白濃度下降，總酶活力升高；酶比活力值排序為為磷酸緩沖液法+丙酮沉淀法＞磷酸緩沖液法+熱變性＞磷酸緩沖液法。綜合圖1和表1分析可知，應選用白皮大蒜經過磷酸緩沖液法+丙酮沉淀法提取物作為此次試驗高活性大蒜SOD來源，對醬腌菜亞硝酸鹽降解及營養品質影響進行的相關試驗。

圖1 大蒜SOD提取物對DPPH的清除率

表1 大蒜SOD提取物酶比活力值

3.3 大蒜SOD提取物對醬腌菜腌制中亞硝酸鹽質量分數及清除效率影響

GB 2714—2015《醬腌菜》規定亞硝酸鹽應符合GB 2762—2017中污染物限量值，故亞硝酸鹽質量分數（以NaNO2計）應≤20 mg/kg。試驗將0～30 d定義為腌制時間。由圖2可知，空白組亞硝酸鹽質量分數呈先升高后下降的趨勢，在腌制第10天左右亞硝酸鹽達到峰值，隨著腌制貯藏時間的延長，亞硝酸鹽質量分數快速下降，并在腌制期30 d后達到安全值范圍，處理組亞硝酸鹽質量分數下降程度在腌制期0～30 d呈顯著差異（p＜0.05），其中0.3%和0.5%組在第5天開始就能有效降低亞硝酸鹽質量分數，有效抑制亞硝酸鹽峰值質量分數，在20 d左右就能使腌制醬腌菜亞硝酸鹽質量分數達到安全值范圍，并在后期持續抑制亞硝酸鹽質量分數。各處理組均對亞硝酸鹽有一定的清除效率，清除率在15 d內隨樣品中添加大蒜SOD提取物濃度的升高而上升，15 d后由于亞硝酸鹽質量分數很低以及添加物的消耗，清除效率減弱，0.3%和0.5%添加物與其余組清除率呈顯著差異（p＜0.05）。綜合所述，在醬腌菜腌制過程中，選用0.3%～0.5%的大蒜SOD提取物對積累的亞硝酸鹽清除較為理想。

圖2 大蒜SOD提取物對醬腌菜亞硝酸鹽質量分數降解及清除效率影響

3.4 大蒜SOD提取在醬腌菜貯藏期間菌落總數的變化

試驗研究的貯藏時間為腌制完成的樣品經包裝未殺菌處理貯藏90 d內考察試驗結果。由表2可知，空白組在40 d已變質，而添加0.3%和0.5%水平添加物醬腌菜在60 d后才出現變質現象，且菌落總數與CK，0.1%和0.2%呈顯著差異（p＜0.05），醬腌菜制品衛生標準規定菌落總數小于1～3×104CFU/g，0.3%和0.5%水平在60 d內符合安全衛生標準，可有效抑制微生物的生長，延長包裝后未經殺菌的醬腌菜的貯藏時間至60 d左右。

表2 醬腌菜貯藏期菌落總數變化 單位：CFU/g

3.5 不同濃度大蒜SOD提取物對醬腌菜貯藏期間氨基酸態氮影響

氨基酸態氮是由醬腌菜中微生物發酵消耗醬腌菜本身蛋白質所產生的，為微生物的生長代謝提供能量，微生物過度繁殖會導致氨基酸態氮質量分數降低，破壞醬腌菜的營養價值，生成的代謝副產物也會影響醬腌菜的風味[19]，由圖3可知，氨基酸態氮（以氮計）隨著醬腌菜貯藏時間的延長總體呈現下降趨勢，處理組各濃度均能減緩下降趨勢，但由于0.1%和0.2%濃度較低，減緩趨勢不明顯，而0.3%和0.5%能夠有效抑制氨基酸態氮的快速下降，并且在60 d內維持在0.5 g/100 g以上水平，兩者差異不明顯（p＞0.05），故綜合成本等因素考慮，選用0.3%～0.5%大蒜SOD提取物較為合適。

圖3 醬腌菜貯藏期氨基酸態氮質量分數變化

3.6 不同濃度大蒜SOD提取物對醬腌菜貯藏期間總酸影響

醬腌菜中總酸質量分數增加主要是因為乳酸菌發酵產生乳酸，還有一些酵母菌發酵產生丁酸等酸性物質，使醬腌菜pH降低[19]，由圖4可知，試驗各組醬腌菜樣品貯藏期間總酸質量分數隨貯藏時間的延長而增加，由于空白樣品無任何添加，總酸質量分數上升最快，0.1%和0.2%提取物雖然能抑制總酸的增加，因其濃度較低，效果不明顯，而0.3%和0.5%可以有效抑制總酸質量分數的增加，在60 d內仍能抑制在1.0 g/100 g以內，符合醬腌菜安全衛生標準。

圖4 醬腌菜貯藏期總酸質量分數變化

3.7 不同濃度大蒜SOD提取物對醬腌菜貯藏期間可溶性糖影響

由圖5可知，醬腌菜在腌制過程中可溶性糖質量分數整體呈下降趨勢，這是因為醬腌菜中微生物利用糖類進行發酵產酸，導致可溶性糖質量分數不斷降低。但隨著腌制時間的延長，環境pH降低，乳酸菌的生長和代謝均受到抑制，其對營養物質的吸收能力也隨之降低，可溶性糖質量分數的降低相對緩慢下來，最后逐漸趨于穩定。0.3%和0.5%處理組在40 d內抑制可溶性糖質量分數下降與CK，0.1%和0.2%組呈顯著差異（p＜0.05），但兩者差異不明顯，故采用0.3%～0.5%提取物較為合適。

圖5 醬腌菜貯藏期可溶性糖質量分數變化

4 討論

目前大量研究以及實踐表明大蒜中天然富含大量超氧化物歧化酶（SOD），從大蒜中提取SOD成本比較低廉，近年來大蒜加工行業發展迅猛，加工副產物的利用得到很好的發展，為大蒜SOD提取提供了豐富的資源基礎。目前大量的研究集中在對大蒜中大蒜素等物質的提取及抗氧化、抗菌等活性的研究，而未涉及對超氧化物歧化酶的提取，對提取物應用于醬腌菜降亞硝酸鹽和改善營養品質方面也缺乏。在消費者日趨注重產品的安全和營養品質的時代，醬腌菜在腌制過程中很容易導致亞硝酸鹽的積累，如何控制腌制階段亞硝酸鹽成為關鍵，此次試驗的創新點在于在試驗范圍內，采用常用的實驗室提取手段對大蒜SOD進行提取，并測定酶活性和對亞硝酸鹽的清除效率，模擬傳統腌制工藝，在未添加任何防腐劑的情況下，研究其對醬腌菜營養品質變化規律，找到清除亞硝酸鹽、改善營養品質的較好的提取物濃度和貯藏時間。由于此次試驗提取物濃度范圍有限以及對實驗室模擬醬腌菜腌制貯藏過程與實際企業生產存在較大差距，所以下一步研究方向將對提取工藝進行優化，還應結合企業實踐中對醬腌菜腌制的工藝類型以及增加提取物濃度范圍進行進一步探討。

5 結論

試驗結果表明，選用0.3%～0.5%的大蒜SOD提取物對醬腌菜進行處理，能有效降低腌制過程中亞硝酸鹽質量分數，降低亞硝酸鹽積累風險，而且能有效減少營養品質流失，理論上在常溫條件下延長未經殺菌處理的醬腌菜貯藏期，其貯藏時間到60 d左右仍能達到品質較好，菌落總數、總酸以及氨基酸態氮質量分數均呈現較好水平。此次試驗為醬腌菜生產企業開發天然保鮮劑及提高醬腌菜產品品質提供了理論依據與指導。