構筑生物傳感器對氰化物的快速檢測

何海寧，劉海龍，楊光瑞，袁彩霞*，洪霞

1.甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司（蘭州 730010）；2.甘肅省商業科技研究所有限公司（蘭州 730010）

乳制品安全是近年來食品安全的焦點之一[1-2]。檢測新技術運用滯后，部分標準缺乏，導致乳制品不安全事件屢禁不絕[3]。乳制品污染多見于原料乳的后期添加不當，如為使乳及乳制品保鮮，向乳中添加過量硫氰酸鈉，若保存條件不當會是硫氰酸轉化成氰基造成食品污染[4-5]；杏仁露中的有害物質之一氰化物主要來源于配料苦杏仁及保存條件不當產生[6-7]。研究表明，氰化物是一類有氰基（CN-）的劇毒化合物，氰根離子（CN-）進入人體后，主要作用于血液，能抑制組織細胞中40多種酶的活性引起整個細胞色素體系的氧化還原障礙，導致機體的氧化還原作用停止，造成細胞窒息，組織缺氧[8-10]。因此，為確保人類身體健康和食品安全，建立快速、有效、經濟、環保的乳制品化學性污染的檢測具有重要意義[11-13]。

相關文獻顯示，食品中氰化物的檢測方法主要有分光光度法[14]、氣相色譜法[15]、離子色譜法[16]、氣相色譜-質譜聯用儀[17]、液相色譜法[19]等。但這些方法檢測效率低，干擾大，數據不可靠，不適用于杏仁露中氰化物的快速檢測[20]。因此，試驗設計一種用β-環糊精功能化石墨烯負載金納米粒子復合材料構筑生物傳感器快速檢測復雜基質杏仁露中氰化物的方法。采用β-環糊精功能化石墨烯，極大地提高石墨烯在水中的溶解度和分散性，功能化石墨烯表面負載金納米粒子復合物構筑生物傳感器對杏仁露中氰化物具有很好的選擇吸附性。利用該納米復合物構筑電化學生物傳感器對杏仁露中氰化物進行快速檢測，操作簡單快速、重現性好、選擇性高。數據可靠，干擾小，檢測的靈敏度高，分析速度快，實用性強。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水中氰成分分析標準物質（99.8%，北京北方偉業計量技術研究院）；磷酸（99.8%，國藥集團化學試劑有限公司）；氯胺T（99.3%，中國計量科學研究院）；丙酮（色譜純，99.6%，西安市永紅化工原料公司）；正己烷（色譜純，99.6%，西安市永紅化工原料公司）；杏仁露樣品（蘭州市華聯超市同期生產的杏仁露）；二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

電子天平（XS 225A-SCS）；渦旋振蕩儀（GENIUS3）；移液管；吸耳球；臺式高速離心機（CF16RXⅡ）；超聲波清洗機（SB-100B）；電化學工作站（CHI600E）。

1.3 試驗方法

1.3.1 金納米粒子的制備

采用抗壞血酸還原法制備金納米粒子。制備過程：按體積比1∶1∶1.5∶25（總體積135～175 mL），分別取質量分數1%的氯金酸溶液、質量分數0.7%的抗壞血酸溶液、摩爾體積濃度0.2 mol/L的碳酸鉀溶液和蒸餾水，將氯金酸溶液、碳酸鉀溶液和蒸餾水混勻，在攪拌的條件下加入抗壞血酸溶液，立即呈現紫紅色；加蒸餾水至500 mL，加熱至溶液變為透明紅色為止，制得粒徑為10～15 nm的金納米粒子。

1.3.2 氧化石墨烯表面的環氧功能化

按40 mL去離子水中加入10 mL質量體積濃度8 mg/mL的氧化石墨烯懸浮液和1.5 mL環氧氯丙烷的比例，分別取去離子水、氧化石墨烯懸浮液和環氧氯丙烷，氧化石墨烯懸浮液加入去離子水中，超聲20～30 min，得到均一氧化石墨烯懸浮液；向該均一氧化石墨烯懸浮液中加入10%氫氧化鈉溶液，待均一氧化石墨烯懸浮液的pH 9.5～10.0后，逐滴加入環氧氯丙烷，在60～80 ℃的溫度下磁力攪拌3～4 h，離心，水洗3次，得環氧基團功能化氧化石墨烯。

1.3.3β-環糊精功能化石墨烯的制備

按質量比1∶10～1∶15，分別取環氧基團功能化氧化石墨烯和β-環糊精，將環氧基團功能化氧化石墨烯完全溶解于pH 9.5～10的碳酸緩沖溶液中，加入β-環糊精，在60～70 ℃的溫度下磁力攪拌3～4 h，用14000 r/min的離心機離心10 min，水洗3次，冷凍干燥，得β-環糊精功能化的氧化石墨烯。

1.3.4 金納米粒子負載β-環糊精功能化石墨烯復合物的制備

按質量比1∶6∶14分別取粉末狀的4-氨基苯硫酚、β-環糊精功能化的氧化石墨烯和金納米粒子，將4-氨基苯硫酚加入無水乙醇中，超聲溶解，加入β-環糊精功能化的氧化石墨烯，超聲30～40 min，加入金納米粒子，磁力攪拌20～24 h；離心分離，干燥。

1.3.5 杏仁露中氰化物的提取及衍生

將硫酸銨溶液作為蛋白沉淀劑，加入杏仁露中，通過鹽析法沉淀杏仁露中的蛋白質，通過離心分離，取上清液定容，在定容后的上清液中加入0.2 mL（1+5）磷酸溶液，渦流混合，加入0.3 mL 10 g/L的氯胺T溶液，立即加蓋密封，渦流混合得到衍生液。

1.3.6 標準溶液配制

氰離子標準系列工作溶液的配制：將購買的水中氰成分分析標準物質配制成10 mg/L儲備液并于冰箱保存，使用時將其儲備液用水稀釋成質量濃度為0，0.001，0.002，0.010，0.050和0.100 mg/L的標準系列工作溶液。準確移取10 mL標準工作溶液于頂空瓶中，加入0.2 mL磷酸溶液（1+5），渦流混合，加入0.3 mL 10 g/L的氯胺T溶液，立即加蓋密封，渦流混合得到衍生液。

1.3.7 電化學檢測

將裸玻碳電極利用三氧化二鋁粉末打磨干凈并在紅外燈下烘干；在打磨干凈的裸玻碳電極表面滴涂1～2滴1 mol/L功能化石墨烯復合物分散液，自然晾干作為工作電極；以鉑電極作為對電極，飽和甘汞電極作為參比電極，將構成三電極電化學生物傳感體系放入杏仁露中氰化物衍生液中，在電壓-0.1～1.0 V，電流0～10 mA通過電化學工作站CHI600E可對氰化物的電化學性能進行研究。

2 結果與討論

2.1 β-環糊精功能化石墨烯負載金納米粒子復合材料的性能表征

圖1（A）和（B）分別是氧化石墨烯納米片的透射電子衍射圖和β-環糊精功能化石墨烯負載金納米粒子復合材料的掃描電子顯微鏡圖。從圖1（A）可以看出，氧化石墨烯表面的褶皺和每一個電子衍射區域，選定區域電子衍射模式說明利用化學法還原可以得到石墨烯納米片晶體結構[21]。圖1（C）和（D）分別是β-環糊精功能化石墨烯負載金納米粒子復合材料的低倍和高倍透射電子衍射圖，金納米粒子均勻地分散在功能化石墨烯表面，金納米粒子的大小為3～10 nm。結果表明，在形成大小均勻、穩定的金納米粒子過程中β-環糊精起著重要作用，并且在長時間超聲過程中金納米粒子也不會從石墨烯表面上脫落，這說明金納米粒子與功能化石墨烯表面具有強的相互作用。研究表明，金納米粒子的尺寸減小到納米尺度時，由于高的比表面積，表面原子數增多及表面原子配位不飽和性導致大量的懸掛鍵，使得納米顆粒的活性遠高于相應塊體材料[22]。墨烯表面的β-環糊精可以有效地阻止石墨烯納米片團聚使其活性面積降低[23]。由于金納米粒子和β-環糊精的特異性及石墨烯大比表面積，提高了該電化學生物傳感器的電化學性能。

圖1 透射電鏡和掃描電鏡圖

2.2 不同納米復合物構筑電化學生物傳感器對杏仁露中氰化物快速檢測及性能研究

探究不同納米復合物構筑電化學生物傳感器對杏仁露中氰化物快速檢測及性能，結果如圖2所示。與裸玻碳電極、金納米粒子修飾電極、石墨烯修飾電極相比較，該β-環糊精功能化石墨烯負載金納米粒子復合材料修飾電極對杏仁露氰化物具有很好的電化學響應。

圖2 不同納米復合物構筑電化學生物傳感器對杏仁露中氰化物快速檢測及性能研究對比

2.3 復合材料構筑電化學生物傳感器對不同濃度氰化物吸附性能研究

為考察該生物傳感器的靈敏度及精確度，通過加標方式探討該復合材料修飾電極對杏仁露不同濃度氰化物吸附性能。從圖3可以看出，該納米復合材料構筑電化學生物傳感器對杏仁露中不同濃度氰化物具有良好線性關系，最低檢出限為0.0056 mg/L。

圖3 復合材料構筑電化學生物傳感器對不同質量濃度氰化物吸附性能研究

2.4 杏仁露氰化物提取過程中衍生劑用量的選擇

如圖4所示，利用不含苦杏仁的杏仁露陰性樣品作為分析物，準確移取7份20 mL該杏仁露于頂空瓶中，編號為1，2，3，4，5，6和，編號1試樣作為空白，其他試樣分別加入20 μL 0.05 mg/L的氰離子標準儲備液，依次添加50，100，200，300，350，400和500 μL 10 g/L的氯胺T衍生劑溶液，從圖4可以觀察氯胺T的用量對響應值的影響情況。由試驗數據可以看出，氯胺T用量達到300 μL后電化學響應最好，即可獲得滿意的試驗結果。

圖4 杏仁露氰化物提取過程中衍生劑用量研究

2.5 衍生pH的選擇

根據有關文獻顯示，溶液的酸堿性對該傳感器有很的大影響，因此可以在頂空瓶中通過加入濃磷酸達到調節pH的目的，結果見圖5。通過觀察對電流響應值的影響，結果表明，電流值隨著pH增大而增大，溶液pH在5.5～6.5范圍內時電流沒有明顯差別，所以選用pH 6作為試驗條件。

圖5 衍生pH的選擇

2.6 沉積時間的選擇

沉積時間是影響傳感器電化學活性的主要因素之一，在陰性樣品中加入30 μL 0.01 mg/L的氰化物標準溶液后，沉積時間選擇20，30，35，40，50，55，60和65 min分別進行考察，結果見圖6。結果顯示，電極表面沉積時間50 min后即達到穩定，故最終沉積時間選擇為50 min。

圖6 沉積時間

2.7 方法的回收率和精密度試驗

選用陰性杏仁露樣品作為基質，取樣品1和樣品2各10 mL，分別加入30和50 μL 10 mg/L的氰離子標準儲備液進行2個濃度水平添加回收試驗，每個添加濃度水平做3個平行樣品。方法的回收率和精密度（用相對標準偏差SRSD表示）數據見表1。

3 結論

試驗提供一種用金納米粒子負載β-環糊精功能化石墨烯復合物構筑電化學生物傳感器，并用該電化學生物傳感器快速檢測杏仁露中氰化物的方法，該方法作為一種新穎的方法相對于現有技術中的色譜法、光譜法、生化法等對杏仁露中氰化物具有很好的選擇性和穩定性。該方法操作簡便、快捷，大幅縮短檢測周期，同時對人體和環境安全，是一種環保、經濟、快速的檢測手段，試驗線性關系良好，準確度和精密度較高，抗干擾小。該試驗為杏仁露的質量保證提供支持，尤其是面對大批量樣品的檢測，更能體現方法的優越性。